FLIM системы Becker & Hickl

Классический метод TCSPC возбуждает образец с помощью импульсного лазера, обнаруживает единичные фотоны флуоресцирующего света и строит распределение фотонов (т.е. гистограммы) плотности фотонов, возбужденных лазерным импульсом от эффективности регистрации фотонов. Этот метод известен с 1961 года. Ограничением классического метода является то, что он одномерный. Он не передаёт изображения напрямую, и он не может использоваться в сочетании с быстрым сканированием, применяющимся в современных лазерных сканирующих микроскопах. Проблема классического TCSPC-метода была решена с помощью многомерного TCSPC, представленного компанией Becker & Hickl в 1993 году. В данном случае процесс записи формирует распределение фотонов не только с течением времени после импульса возбуждения, но и по другим параметрам, таким как положение лазерного луча в области сканирования в момент регистрации фотона, длина волны фотонов или время от начала эксперимента. Применение многомерного TCSPC-метода в лазерной сканирующей микроскопии показано на рисунке.

Сканирующая головка микроскопа сканирует исследуемый образец сфокусированным пучком импульсного лазера высокой частоты. Для каждого обнаруженного фотона в TCSPC-приборе определяется время t, период лазерного импульса, местоположение лазерного пятна x, y в области сканирования. Из этих параметров строится распределение фотонов по пространственным координатам x, y и времени фотонов t. Процесс записи продолжается в течение большого числа периодов до тех пор, пока полезный уровень сигнал-шум фотонного распределения не будет достигнут. Из всех электронных FLIM-методов многомерный TCSPC-метод обеспечивает наиболее высокое временное разрешение. Он также позволяет получить лучшую точность времени жизни, или эффективность регистрации фотонов, при заданным числе фотонов зарегистрированных от образца. Метод TCSPC-FLIM имеет ряд других особенностей, важных для визуализации времени жизни биологичеких систем: он способен решать сложные профили кинетики затухания и устойчив к  динамическим изменениям параметров затухания флуоресценции. Кроме того, метод TCSPC-FLIM прекрасно совместим с конфокальной и многофотонной лазерной сканирующей микроскопией. Он не имеет никаких проблем совместимости с высокой скоростью сканирования используемой в этих системах: процесс записи продолжается в течение всего времения сканирования для получения необходимого соотношения сигнал-шум. Кроме того метод TCSPC FLIM использует оптические срезы конфокального или многофотонного сканирования: данные получены из точно определённой боковой позиции и с точно определённой плоскостью в образце, без загрязнения боковым рассеянием и внефокусной флуоресценцией.