Фильтры для флуоресцентных микроскопов

Флуорофоры

Флуорофор – это молекула или часть молекулы, способная флуоресцировать. При попадании излучения, частота которого соответствует частоте возбуждения, молекула переходит из основного состояния в возбужденное. Однако возбужденное состояние неустойчиво, через некоторое время (обычно 10^-15 - 10^-9 с) произойдет испускание фотона, и молекула вернется на более низкий энергетический уровень. Из-за вибрационных, тепловых и звуковых потерь энергии длина волны этого излучения будет больше, чем длина волны поглощенного света.

Один флуорофор может непрерывно возбуждаться, если он не разрушен, то есть пока не произошло фотообесцвечивания - необратимого разрушения флуорофора из-за химического повреждения или ковалентной модификации, вызванной излучением. Среднее число циклов возбуждения и эмиссии, которое может пройти конкретный флуорофор до фотообесцвечивания, зависит от его молекулярной структуры и окружающей среды; некоторые флуорофоры разрушаются быстро, после испускания всего нескольких фотонов, в то время как другие могут пройти цикл по тысяче и даже миллиону раз.

Фильтры для флуоресцентного микроскопа

Экспериментальная установка содержит фильтры, часто используемые в эпифлуоресцентной микроскопии – это вид микроскопии, в которой возбуждающее и эмиссионное излучение проходят через объектив микроскопа. Путем тщательного выбора соответствующих фильтров и зеркал можно увеличивать соотношение сигнал-шум. Как видно из схемы, три типа фильтров используются для максимизации сигнала флуоресценции и минимизируют при этом нежелательное излучение. Каждый оптический элемент подробно описан далее.\

Рисунок 1. Схема хода луча в флуоресцентном микроскопе. To image – формирование изображения. Fluorescence – флуоресценция. Filter cube – фильтрующий блок. Emission filter – эмиссионный фильтр. Excitation filter – возбуждающий фильтр. Dichroic mirror – дихроичное зеркало. Objective - объектив. Sample plane – плоскость образца

Фильтр возбуждения

Возбуждающий фильтр пропускает узкий диапазон длин волн вокруг пиковой длины волны возбуждения флуорофора. По графику видно, что полоса пропускания, соответствующая передаче более 90% сигнала при прохождении сквозь фильтр возбуждения желтого флуоресцентного белка (YF) (MF497-16), составляет 489-505 нм; падающее излучение вне этого диапазона либо частично (для областей вблизи области передачи), либо полностью (для отдаленных областей) блокируется.

Дихроичное зеркало

Дихроичные зеркала предназначены для отражения света, длина волны которого ниже определенного значения – длины волны отсечки. В микроскопе дихроичное зеркало направляет нужный диапазон длин волн как на образец, так и на плоскость изображения. Длина волны отсечки соответствует 50% -ной передаче сигнала. Как показано на графике справа, длина волны отсечки дихроичного зеркала (MD515) для желтого флуоресцентного белка (YFP) составляет ~ 515 нм.

Поместив одно из этих зеркал в экспериментальную установку под углом 45 ° к падающему пучку, излучение возбуждения (обозначено синим цветом) отражается от поверхности дихроичного зеркала и попадает на образец, проходя через объектив микроскопа, в то время как флуоресценция, излучаемая образцом (красный цвет на схеме), проходит через зеркало к системе обнаружения.

Хотя дихроичные зеркала выполняют важные функции в флуоресцентной микроскопии, у этих приборов есть некоторые недостатки. Речь идет о блокировании нежелательного света; как правило, ~ 90% света на длинах волн ниже значения длины волны отсечки отражаются и ~ 90% света на длинах волн выше этого значения зеркало пропустит. Следовательно, часть излучения возбуждения может передаваться через дихроичное зеркало вместе с флуоресценцией большей длины волны, испускаемой образцом. Чтобы предотвратить попадание этого нежелательного света в систему обнаружения, помимо дихроичного зеркала используется фильтр излучения.

Рисунок 2. График пропускания набора фильтров. Обратите внимание, что дихроичное зеркало (зеленый) отражает свет в диапазоне длин волн возбуждения (синий) и передает сигнал в диапазоне длин волн излучения (зеленый)

Эмиссионный фильтр

Эмиссионный фильтр служит для того, чтобы блокировать нежелательное излучение. Подобно фильтру возбуждения, этот фильтр пропускает определенную полосу длин волн вокруг пиковой длины волны излучения флуорофора. Как показано на графике справа, полоса пропускания эмиссионного фильтра(MF535-22), соответствующая передаче более 90% сигнала от желтого флуоресцентного белка (YF) составляет 524 - 546 нм; падающее излучение вне этого диапазона либо частично (для областей вблизи области передачи), либо полностью (для областей, удаленных от полосы пропускания) блокируется фильтром.

© Thorlabs Inc.

Компания INSCIENCE помогает своим заказчикам решать любые вопросы и потребности по продукции Thorlabs на территории РФ