Фильтры для флуоресцентных микроскопов

Дата публикации: 29.01.2019 14:00

Флуорофоры

Флуорофор – это молекула или часть молекулы, способная флуоресцировать. При попадании излучения, частота которого соответствует частоте возбуждения, молекула переходит из основного состояния в возбужденное. Однако возбужденное состояние неустойчиво, через некоторое время (обычно 10^-15 - 10^-9 с) произойдет испускание фотона, и молекула вернется на более низкий энергетический уровень. Из-за вибрационных, тепловых и звуковых потерь энергии длина волны этого излучения будет больше, чем длина волны поглощенного света.

Один флуорофор может непрерывно возбуждаться, если он не разрушен, то есть пока не произошло фотообесцвечивания - необратимого разрушения флуорофора из-за химического повреждения или ковалентной модификации, вызванной излучением. Среднее число циклов возбуждения и эмиссии, которое может пройти конкретный флуорофор до фотообесцвечивания, зависит от его молекулярной структуры и окружающей среды; некоторые флуорофоры разрушаются быстро, после испускания всего нескольких фотонов, в то время как другие могут пройти цикл по тысяче и даже миллиону раз.

Фильтры для флуоресцентного микроскопа

Экспериментальная установка содержит фильтры, часто используемые в эпифлуоресцентной микроскопии – это вид микроскопии, в которой возбуждающее и эмиссионное излучение проходят через объектив микроскопа. Путем тщательного выбора соответствующих фильтров и зеркал можно увеличивать соотношение сигнал-шум. Как видно из схемы, три типа фильтров используются для максимизации сигнала флуоресценции и минимизируют при этом нежелательное излучение. Каждый оптический элемент подробно описан далее.\

Epi_General_D3-780

Рисунок 1. Схема хода луча в флуоресцентном микроскопе. To image – формирование изображения. Fluorescence – флуоресценция. Filter cube – фильтрующий блок. Emission filter – эмиссионный фильтр. Excitation filter – возбуждающий фильтр. Dichroic mirror – дихроичное зеркало. Objective - объектив. Sample plane – плоскость образца

Фильтр возбуждения

Возбуждающий фильтр пропускает узкий диапазон длин волн вокруг пиковой длины волны возбуждения флуорофора. По графику видно, что полоса пропускания, соответствующая передаче более 90% сигнала при прохождении сквозь фильтр возбуждения желтого флуоресцентного белка (YF) (MF497-16), составляет 489-505 нм; падающее излучение вне этого диапазона либо частично (для областей вблизи области передачи), либо полностью (для отдаленных областей) блокируется.

Дихроичное зеркало

Дихроичные зеркала предназначены для отражения света, длина волны которого ниже определенного значения – длины волны отсечки. В микроскопе дихроичное зеркало направляет нужный диапазон длин волн как на образец, так и на плоскость изображения. Длина волны отсечки соответствует 50% -ной передаче сигнала. Как показано на графике справа, длина волны отсечки дихроичного зеркала (MD515) для желтого флуоресцентного белка (YFP) составляет ~ 515 нм.

Поместив одно из этих зеркал в экспериментальную установку под углом 45 ° к падающему пучку, излучение возбуждения (обозначено синим цветом) отражается от поверхности дихроичного зеркала и попадает на образец, проходя через объектив микроскопа, в то время как флуоресценция, излучаемая образцом (красный цвет на схеме), проходит через зеркало к системе обнаружения.

Хотя дихроичные зеркала выполняют важные функции в флуоресцентной микроскопии, у этих приборов есть некоторые недостатки. Речь идет о блокировании нежелательного света; как правило, ~ 90% света на длинах волн ниже значения длины волны отсечки отражаются и ~ 90% света на длинах волн выше этого значения зеркало пропустит. Следовательно, часть излучения возбуждения может передаваться через дихроичное зеркало вместе с флуоресценцией большей длины волны, испускаемой образцом. Чтобы предотвратить попадание этого нежелательного света в систему обнаружения, помимо дихроичного зеркала используется фильтр излучения.

MDF-YFP

Рисунок 2. График пропускания набора фильтров. Обратите внимание, что дихроичное зеркало (зеленый) отражает свет в диапазоне длин волн возбуждения (синий) и передает сигнал в диапазоне длин волн излучения (зеленый)

Эмиссионный фильтр

Эмиссионный фильтр служит для того, чтобы блокировать нежелательное излучение. Подобно фильтру возбуждения, этот фильтр пропускает определенную полосу длин волн вокруг пиковой длины волны излучения флуорофора. Как показано на графике справа, полоса пропускания эмиссионного фильтра(MF535-22), соответствующая передаче более 90% сигнала от желтого флуоресцентного белка (YF) составляет 524 - 546 нм; падающее излучение вне этого диапазона либо частично (для областей вблизи области передачи), либо полностью (для областей, удаленных от полосы пропускания) блокируется фильтром.

Компания INSCIENCE помогает своим заказчикам решать любые вопросы и потребности по продукции Thorlabs на территории РФ

Новые статьи

Характеристика свойств субхондральной кости человека с помощью спектроскопии в ближней инфракрасной области (БИК)

Дегенеративные заболевания суставов часто характеризуются изменениями свойств суставного хряща и субхондральной кости. Эти изменения часто связаны с толщиной субхондральной пластинки и морфологией трабекулярной кости. Таким образом, оценка целостности субхондральной кости может дать важные сведения для диагностики патологий суставов. В данном исследовании изучается потенциал оптической спектроскопии для характеристики свойств субхондральной кости человека. Образцы остеохондральной кости (n = 50 – количество образцов) были извлечены из коленного сустава трупа человека (n = 13) в четырех анатомических точках и подвергнуты БИК-спектроскопии(в ближней инфракрасной области). Затем образцы были исследованы с помощью микрокомпьютерной томографии для определения морфометрических характеристик субхондральной кости, включая: толщину пластинки (Sb.Th), толщину трабекул (Tb.Th), объемную долю (BV/TV) и индекс модели структуры (SMI). Связь между свойствами субхондральной кости и спектральными данными в 1-м (650 - 950 нм), 2-м (1100 - 1350 нм) и 3-м (1600-1870 нм) оптических окнах была исследована с помощью многомерного метода частичных наименьших квадратов (PLS) регрессии. Значимые корреляции (p < 0.0001) и относительно низкие ошибки прогнозирования были получены между спектральными данными в 1-м оптическом окне и Sb.Th (R²= 92.3%, ошибка = 7.1%), Tb.Th (R²= 88.4%, ошибка = 6.7%), BV/TV (R²= 83%, ошибка = 9.8%) и SMI (R²= 79.7%, ошибка = 10.8%). Таким образом, БИК-спектроскопия в 1-м тканевом оптическом окне способна характеризовать и оценивать свойства субхондральной кости и потенциально может быть адаптирована во время артроскопии.

Моделирование нервного волокна на основе оптического волновода

Миелинизированные аксоны являются многообещающими кандидатами для передачи нервных сигналов и света ввиду их волноводных структур. С другой стороны, с появлением таких заболеваний, как рассеянный склероз и нарушений формирования и передачи нервных сигналов из-за демиелинизации, понимание свойств миелинизированного аксона как волновода приобретает большую важность. Настоящее исследование направлено на то, чтобы показать, что профиль показателя преломления (ПП) миелинизированного аксона играет существенную роль в передаче лучей в нем.

Оптимизация обнаружения сверхслабых световых потоков

В ходе исследования, описанного в данной статье, были объединены статистическая модель, анализ шумов детектора и эксперименты по калибровке. Согласно результатам, видимый свет может быть обнаружен с помощью ПЗС камеры с электронным умножителем с соотношением сигнал/шум, равным 3, для потоков с количеством фотонов менее 30 фотонов с⁻¹ см⁻².

Диагностика импульсного плазменного потока

Импульсные плазменные потоки в плазменных ускорителях широко используются для решения ряда научных и практических задач. Особый интерес среди применений импульсных плазменных потоков представляют термоядерный синтез и астрофизические исследования, например, экспериментальное исследование взаимодействия импульсного плазменного потока с материалами.

Полные высокопроизводительные настольные системы сканирования HSI PUSH-BROOM

Применение гиперспектральной визуализации заметно расширилось за последние годы. Тем не менее, остается общая проблема, а именно: предоставление полного интегрированного решения для фиксации 2-D гиперспектральных изображений в компактном настольном формате, которое предоставляет подробную спектральную информацию для определения компонентов, количества и их распределения в плоскости сканирования.

Автофлуоресцентная микроскопия — идентификация бактериальных сигналов на образцах горных пород

Распространенным методом обнаружения микробов в жидких и нежидких образцах является окрашивание флуоресцентными красителями, при котором образцы окрашиваются флуорофором, возбуждаемым фотонами от источника света. Флуорофоры — это молекулы, которые проявляют флуоресценцию, и могут быть биомолекулами естественного происхождения (в этом случае флуоресценция называется автофлуоресценцией), флуоресцентными красителями (синтезированными молекулами) или минералами. Конкретные применения красителей включают обнаружение и перечисление бактерий, визуализацию экспрессии генов и обнаружение биомолекул, которые иначе невозможно было бы отследить.