Лазерная сканирующая микроскопия

Создание контрастных изображений высокого разрешения обеспечивает точность микроскопического исследования. Так же, как через телескоп ученые изучают самые отдаленные части вселенной, так и с помощью методов микроскопии биологические процессы можно отслеживать в наномасштабе. Современные лазерные микроскопы генерируют многомерные данные (X, Y, Z, τ, λ), и существующие методы профилирования заметно упрощают изучение различных биологических процессов.

В обычной широкопольной микроскопии (рис. 1) высококачественные изображения получаются только при изучения тонких образцов толщиной до двух слоев клеток. Однако зачастую в исследованиях необходимо более глубокое профилирование областей, и для построения изображения требуются методы объемного рендеринга, недоступные обычным микроскопам.

Методы конфокальной и многофотонной лазерной микроскопии позволяют визуализировать срезы многослойного образца – этот метод известен как оптическое секционирование. В конфокальной лазерной микроскопии эмиссионное излучение вне фокуса отсекается точечной диафрагмой в отличие от многофотонной лазерной микроскопии, где фонового излучения не возникает вообще. Полученные серии изображений на различных глубинах фокальной плоскости внутри образца позволяют реконструировать трехмерное изображение.

Контрастирование в лазерной микроскопии

При сканировании биологических тканей часто применяют методы флуоресценции. Применение этих методов позволяет увеличивать контраст изображения, что облегчает исследование структуры образца.

При флуоресценции светоизлучающая молекула заметна на фоне других молекул, составляющих структуру. Биоткань может содержать такие молекулы - эндогенные флуорофоры; также их внедряют извне - химически или через связывание с антителом, либо трансфицируют флуоресцентные белки в клетку.

Чтобы молекула начала излучать свет - флуоресцировать, необходимо, чтобы сначала свет (фотон) с соответствующим количеством энергии поглотился. Молекула должна перейти в возбужденное состояние, как показано на рисунке 3-А. Излучение происходит, когда молекула возвращается обратно из возбужденного состояния в основное. Количество флуоресценции пропорционально интенсивности (I) падающего лазера, и поэтому конфокальную лазерную микроскопию часто относят к методам линейной визуализации. Естественные потери в процессе релаксации заключаются в том, что излучаемый фотон имеет меньшую энергию и, соответственно, большую длину волны, чем поглощенный фотон.

Многофотонное возбуждение (рис. 3-B) молекулы происходит, когда два (или более) фотона, энергии которых в сумме удовлетворяют количеству энергии, необходимой для квантового перехода, поглощаются одновременно. В этом случае два поглощенных фотона будут иметь меньшую энергию, чем излучаемый флуоресцирующий фотон.

Существуют также схемы многофотонного контрастирования - генерация гармоник и генерация суммарной частоты, эти процессы не требуют поглощения энергии. При генерации гармоник падающие фотоны аннигилируют, после чего создается новый фотон, обладающий суммарной энергией, как показано на рисунке 3-С.

Далее составные компоненты исследуются путем наблюдения за физическим порядком генерации гармоник. При генерации второй гармоники (ГВГ) излучение создается только в составных элементах, которые сильно упорядочены и не имеют инверсионной симметрии. Генерация третьей гармоники (ГТГ) наблюдается на границах кристаллов, где происходит изменение показателя преломления. Двухфотонное возбуждение и генерация второй гармоники - нелинейные процессы, так как излучение зависит от квадрата интенсивности.

Нелинейный характер генерации излучения в многофотонной микроскопии означает, что для исследования генерации второй и третьей гармоник необходимы высокие плотности фотонов. Для этого при низкой средней мощности для исследования образцов применяются фемтосекундные импульсные лазеры с фазовой синхронизацией, в частности титано-сапфировые лазеры.

Другая отличительная черта линейной микроскопии – длина волны для возбуждения конкретного флуорофора. Сперва можно подумать, что длина волны возбуждения должна в два раза превышать длину излучения при однофотонном поглощении, однако для возбуждения большинства флуорофоров требуются различные длины волн при одно- и двухфотонном поглощении. Существуют отдельные спектры для этих видов поглощения. Спектры двухфотонного поглощения часто значительно шире (> 100 нм), непохожи на гладкие полугауссовые кривые. Широкий спектр двухфотонного поглощения многих флуорофоров упрощает возбуждение нескольких флуоресцентных молекул одним лазерным излучением.

 Все возбуждаемые флуорофоры имеют разный пик возбуждения, при этом технически необходимо, чтобы длины волн перекрывались и имели общий диапазон возбуждения. Возбуждение множества флуорофоров обычно достигается «компромиссным» способом – подбором такой длины волны, которая возбуждает все флуорофоры для достижения необходимого уровня эффективности.

Процессы с поглощением (A, B):

Поглощение одного или нескольких фотонов (λ_EX) переводит молекулу из состояния покоя (S₀) в состояние возбуждения (S₁). Флуоресцентное излучение (λ_EM) происходит при переходе молекулы из возбужденного состояния в состояние покоя.

Процессы без поглощения (C):

Возбужденные фотоны (λ_EX) одновременно объединяются в один фотон (λ_SHG,THG) с суммарной энергией двух фотонов и половиной длины волны (при ГВГ), либо с одной третью длины волны (при ГТГ).

Формирование изображения

В точечных сканирующих системах устройство выполняет сканирование образца рабочим пятном с дифракционным пределом, выходные сигналы формируются в изображение. Двумерная анфас-проекция строится с помощью массива данных, построенного последовательным методом.

Освещаемый объем излучает сигнал, который попадает на одноэлементный детектор. Наиболее распространенным одноэлементным детектором является фотоумножитель, иногда встречаются лавинные фотодиоды. ПЗС-камеры в таких микроскопах обычно не используются, однако именно эти детекторы используются для обработки мультифокального изображения.

Сигнал от детектора передается компьютеру, который строит двумерное изображение в виде массива интенсивностей для каждого пятна по поверхности образца. Поскольку реальное изображение не формируется, лазерные сканирующие системы считаются цифровой технологией визуализации.

Основным преимуществом такого сканирования и распознавания является то, что параметры итогового изображения и поля сканирования можно настраивать в соответствии с конкретными условиями, независимо от технических характеристик системы.

Конфокальная лазерная микроскопия

Датчик – точечная диафрагма (пинхол) – дихроичное зеркало – точечная диафрагма источника света (расширитель пучка) | сканирующая оптика | линзовая система –объектив

В конфокальных лазерных микроскопах используется точечная подсветка от одномодового оптоволоконного лазера непрерывного действия. Таким образом происходит оптическое разделение. Лазерное излучение коллимируется и используется для подсветки сканируемого образца. Свет от образца попадает на объектив и проходит через сканирующую систему до момента попадания на детектор. Перед детектором размещена точечная диафрагма с ограничением дифракции – пинхол.

После прохождения через сканирующую систему, луч лазерной подсветки попадает на светоделительную пластину – дихроичное зеркало, а затем фокусируется. Конфокальная точечная диафрагма нужна для блокировки излучения, генерируемого вне фокальной плоскости. Изображение получается разделенным на некоторые области.

После конфокального отверстия располагается детектор (рисунок 4). Справедливо предположить, что характеристики изображения напрямую зависят от диаметра пинхола – меняя диаметр отверстия, меняется контрастность изображения и размер сечений.

Разрешающая способность конфокального микроскопа в боковом направлении зависит от характеристик пятна с ограничением дифракции, с помощью которого и осуществляется сканирование. А характеристики пятна, в свою очередь, определяются качествами лазерного излучения, сканирующей оптики и свойствами объектива.

В качестве источника света в основном используют одномодовый оптоволоконный лазер. Лазерный луч нужен в качестве источника возбуждения (гауссовский точечный источник). Луч коллимируется и фокусируется в пучок с ограничением дифракции.

В системе обработки изображения с отсутствием аберраций, где используются оптические элементы высокого качества, размер этого пятна в условиях равномерного освещения определяется как функция длины волны возбуждающего излучения (λ_EX) и числовой апертуры (NA) объектива.

Spot Size = (1,22 * λ_EX ) / NA

Уравнение 1. Размер пятна.

Лазерный луч фокусируется в точку. Но на самом деле, то, что принято называть точкой – не точка, а концентрические кольца, напоминающие мишень. Таким образом, размер пятна - это расстояние между нулями диска Эйри (диаметр до середины первого кольца от центра мишени) и измеряется в относительных единицах, называемых Airy Unit (AU).

Латеральное разрешение системы визуализации определяется как минимальное расстояние между двумя точками наблюдения, используемых в качестве отдельных объектов. В экспериментах с конфокальным, как и с многофотонным лазерным микроскопом удобно латеральное разрешение принимать за величину полной ширины на полувысоте (FWHM).

Тогда формула для вычисления латерального разрешения примет вид:

R_{lateral,confocal} = (0,51 * λ_EX ) / NA

Уравнение 2. Латеральное разрешение конфокального лазерного микроскопа.
 

Разрешение по оси:

R_{axial,confocal} = (0,88 * λ_EX ) / n - √(n²-(NA)²)

Уравнение 3. Осевое разрешение конфокального лазерного микроскопа, где n - показатель преломления иммерсионной среды.

Следует отметить, что в отличие от широкопольных микроскопов, где разрешение по поверхности зависит только от длины излучения, в конфокальных лазерных системах латеральное разрешение определяется длиной возбуждающего излучения.

Чтобы определить размер конфокального отверстия, нужно умножить размер пятна возбуждения на общее увеличение микроскопа:

R_pinhole = M_objective * M_{scan head} * Spot Size

Уравнение 4. Диаметр пинхола. 

Пример расчета: размер пинхола для объектива 60-кратного увеличения с NA = 1,0 и длины возбуждающего излучения λ_EX= 488 нм (M_{scan head} = 1.07 для объективов Thorlabs) будет составлять 38,2 мкм, то есть пинхол диаметром 1 АU. Если эти же значения применить для объектива 40Х, то размер пинхола составил бы 25,5 мкм, такая диафрагма тоже называлась бы отверстием диаметром в 1 АU, так как единицы AU – относительны и принимаются за стандарт системы.

Теоретически общая разрешающая способность конфокального микроскопа определяется как функция от размера пятна подсветки и диаметра пинхола, то есть разрешение всей оптической системы можно увеличить, уменьшая диаметр пинхола. С точки зрения практики, уменьшив размер точечной диафрагмы, можно добиться увеличения разрешения – однако при этом уменьшится и количество излучения, дошедшего до детектора. Оптимальным размером пинхола считается величина в 1 AU – именно в это случае достигается наилучшее соотношение между качеством сигнала, разрешением и конфокальностью.

Многофотонная лазерная микроскопия

Рисунок 5 Схема хода лучей в многофотонном лазерном микроскопе

(Луч подсветки – сканирующая система – сканирующие линзы – линзовая система –дихроичное зеркало – детектор – объектив)

В многофотонных сканирующих системах используется атмосферный короткоимпульсный лазер. Излучается коллимированный свет, который проходит через систему сканирования и фокусируется объективом. В таких системах вероятность возникновения многофотонного поглощения очень низка: это связано с квадратичной зависимостью сигнала (I²) от мощности падающего излучения. Таким образом сигнал ограничивается фокальной плоскостью объектива, и вне фокальной плоскости излучения практически не формируется. Устранение фоновой вуали позволяет осуществлять оптическое секционирование (рис. 2) без необходимости наличия конфокальной точечной диафрагмы.

В такой конструкции отраженный сигнал не должен проходить через систему сканирования. Поэтому детектор располагается ближе к объективу, чтобы максимизировать эффективность сбора излучения, как показано на рисунке 5. Детектор, расположенный на схеме перед сканирующей системой, называется неконфокальным детектором.

Вновь воспользовавшись значением полной ширины на полувысоте, формула для вычисления поверхностного разрешения многофотонного лазерного микроскопа примет вид:

R_{lateral,multiphoton,NA>0,7} = (0,383 * λ_EX ) / NA^0,91

Уравнение 5. Поверхностное разрешение лазерного многофотонного микроскопа.
 

Осевое разрешение найдется из уравнения вида:

R_{axial,multiphoton,NA>0,7} = (0,626 * λ_EX ) / n - √(n²-(NA)²)

Уравнение 6. Осевое разрешение многофотонного лазерного микроскопа.

Уравнения выведены для объективов с числовой апертурой > 0.7, практически все многофотонные сканирующие системы имеют такие параметры.

Из уравнения 5 можно сделать вывод, что по сравнению с конфокальными микроскопами увеличение длины волны возбуждающего излучения в многофотонных системах ведет к уменьшению разрешения почти в 2 раза. В случае идеального точечного объекта из-за характера зависимости интенсивности сигнала (I²) эффективный фокальный объем уменьшается, что компенсирует увеличение размера пятна подсветки.

Следует отметить, что боковое и осевое разрешения зависимы от интенсивности. По мере увеличения мощности лазерного излучения растет вероятность генерации сигнала внутри фокального объема с ограничением дифракции. На практике поверхностное разрешение в многофотонных сканирующих микроскопах достигает предельного значения тогда, когда луч подсветки максимально сфокусирован и приближен эмпирически уравнением 5 при умеренной интенсивности. Осевое разрешение по мере увеличения мощности возбуждающего излучения будет ухудшаться.

Параметры изображения

Несмотря на то, что прямого рендеринга не происходит, в лазерной микроскопии при обработке изображений необходимо правильно рассчитать размер поля изображения, разрешение захвата и разрешение по плоскости. Разрешающая способность в поперечном направлении важна при визуализации анфас-проекции. Для более точного отображения всех деталей необходимо правильно подобрать разрешение как при захвате, так и в боковом направлении поля сканирования. Разрешение захвата должно соответствовать оптическому разрешению.

В лазерной микроскопии мы обычно полагаемся на правило Найквиста, где размер пикселя определяется боковым разрешением, разделенным на 2.3. К примеру, для объектива 60-кратного увеличения боковое разрешение составляет 249 нм (по уравнению 2), а размер пикселя в конечном изображении - 108 нм.

Поэтому для разрешения захвата 1024 x 1024 пикселей поле сканирования составит ~ 111 мкм × 111 мкм. Следует отметить, объектив 40-кратного увеличения из предыдущего примера даст те же размеры поля сканирования (оба объектива имеют одинаковое раскрытие) в выборке. Единственное различие между двумя изображениями - это угол наклона сканеров.

Однако высокое разрешение при обработке изображений требуется далеко не всегда. Существуют альтернативные настройки системы, применяя которые можно получать качественные и точные изображения.

Визуализация в исследованиях живых клеток

Одним из значимых применений методов лазерной микроскопии являются исследования живых клеток и тканей. Но некоторые побочные эффекты флуоресценции могут быть цитотоксичными. Необходимо соблюдать ряд требований, чтобы сохранить точность исследования без вреда для биологических образцов.

Важную роль во флуоресцентной микроскопии играет насыщение флуорофора. Насыщение происходит, когда в ответ на увеличение мощности лазера не происходит увеличения флуоресцентного излучения. Это случается, когда 10% флуорофоров находятся в возбужденном состоянии.

Причиной насыщения является количество времени, в течение которого флуорофор переходит в основное состояние после первого возбуждения. Скорость реакции флуоресценции относительно велика и составляет от сотни пикосекунд до нескольких наносекунд, в то время как преобразование триплетного состояния белка и безызлучательный распад требуют значительно большего времени для перехода в основное состояние. Кроме того, повторное возбуждение флуорофора до того, как он расслабится до основного состояния, может привести к необратимому фотообесцвечиванию флуорофора. При медленном возбуждении клетки могут задействовать собственные внутренние механизмы для борьбы с цитотоксичностью от флуоресценции.

Одним из способов уменьшения фотообесцвечивания и связанной с ним цитотоксичности является быстрое сканирование. Уменьшив количество времени, затрачиваемого лазером на одну точку изображения, пропорционально уменьшается и количество излучения. Процессы фотообесцвечивания замедляются, так как флуорофор может перейти в основное состояние до следующего сканирования. Если скорость не является основным требованием, можно повысить точность, усредняя или объединяя снимки.

Увеличение длины волны возбуждения и возможность неконфокального детектирования в многофотонной лазерной микроскопии расширяют возможности исследований биоткани. Длинные волны менее восприимчивы к рассеянию на образце из-за обратной энергетической зависимости четвертой степени (I^-4) рассеяния на длине волны. Обычно глубина проникновения для многофотонного лазерного микроскопа составляет 250-500 мкм (хотя в литературе были найдены значения около 1 мм), а для конфокального - около 100 мкм.

© Thorlabs Inc.

Компания INSCIENCE помогает своим заказчикам решать любые вопросы и потребности по продукции Thorlabs на территории РФ