Аннотация
Результат онкологических операций в значительной степени зависит от точности определения поля обзора для оценки краев резекции in-situ. Врачи вынуждены ждать результатов патологоанатомической лаборатории до двух недель для подтверждения послеоперационного диагноза, что может привести к необходимости последующего лечения. В настоящее время не существует инструментов для визуализации значимой с точки зрения диагностики информации о тканях in situ. В данной статье представлено описание микроскопии для бесконтактной безмаркерной визуализации морфологии клеток человека с помощью аппарата в отражательном режиме. Эта возможность обеспечивается новым методом дистанционной фотоакустической микроскопии, который позволяет бесконтактно определять контраст оптического поглощения. Благодаря использованию пика поглощения ДНК на 266 нм, с помощью фотоакустического дистанционного зондирования можно эффективно восстановить информацию о клеточном ядре, аналогичную по содержанию той, которую восстанавливают с помощью анализа образцов, приготовленных по общепринятому стандартному методу окрашивания гематоксилином и эозином (Г&Э).
Введение
Разрабатываются новые методы интраоперационной визуализации, которые являются альтернативой методам интраоперационной гистопатологической диагностики. В более ранних исследованиях использовались микроскопия плоскостного освещения, флуоресцентная нелинейная микроскопия, микроскопия с УФ-возбуждением поверхности (MUSE) и структурированная световая микроскопия для получения гистологических изображений с помощью окрашивания Г&Э. Однако эти маркерные методы могут потребовать дополнительных флуоресцентных красителей или оптической очистки образца для получения изображения, а также создать проблемы материально-технического обеспечения во время операции и иметь потенциальный токсический эффект в зависимости от контрастирующего вещества.
Фотоакустические методы обладают преимуществом использования эндогенного контраста оптического поглощения, присутствующего в тканях. Поглощение хромофором наносекундного импульса вызывает внезапное изменение температуры, которое приводит к временному термоупругому расширению, в свою очередь, генерирующему акустические волны в ультразвуковом диапазоне. Кроме того, ткань человека демонстрирует высокую специфичность в кривых оптического поглощения, что обеспечивает эффективную дифференцировку тканей.
Для визуализации морфологии клеток пик УФ-поглощения ДНК является хорошей мишенью. Стандартные методы УФ-фотоакустической микроскопии продемонстрировали эффективную безмаркерную визуализацию клеточной структуры в образцах тканей. Действительно, в некоторых недавних работах приведены убедительные доводы относительно качества гистологической визуализации. Однако методы УФ-фотоакустической микроскопии требуют контакта с тканью с помощью среды распространения акустических колебаний, что может быть непрактично из-за ограниченного рабочего пространства, повышенного риска инфекции и необходимости дорогостоящей пред- и послеоперационной стерилизации.
Остается неудовлетворенной потребность в безмаркерной визуализации в клеточном масштабе оптически толстых (намного толще, чем средняя длина свободного пробега) образцов в режиме реального времени. Для толстых образцов требуется устройство с отражательным режимом, которое больше подходит для клинических применений in-situ. В данной статье представлен оптический, быстрый, глубокий, безмаркерный и бесконтактный метод оптической визуализации с клеточным разрешением в отражательном режиме с использованием новейшей технологии дистанционного фотоакустического зондирования (PARS). Отличительной особенностью дистанционного фотоакустического зондирования является бесконтактность даже в сантиметровом масштабе, что позволяет визуализировать контраст оптического поглощения в мутных средах без необходимости среды для распространения акустических колебаний, например, воды или ультразвукового геля. Задачей метода является извлечение сведений гистопатологического характера для диагностики.
При дистанционном фотоакустическом зондировании наносекундный возбуждающий пучок фокусируется совместно с непрерывным зондирующим пучком на мишень. С помощью пика УФ-поглощения ДНК можно визуализировать ядра клеток и объемную структуру ткани. В данной работе представлены первые гистологические изображения тканей молочной железы, желудочно-кишечного тракта и кожи в виде фиксированных в формалине парафинизированных блоков (FFPE-блоков) и неокрашенных тонких срезов, полученные бесконтактным и безмаркерным способом с помощью дистанционного фотоакустического зондирования.
Методы
Экспериментальное устройство
В микроскопе для дистанционного фотоакустического зондирования, используемом в исследовании (как показано на рисунке 1), излучение расщепляется на два пучка. Возбуждающий пучок, обеспечивающий контраст оптического поглощения, исходит от импульсного источника 266 нм 0,5 нс, в то время как зондирующий пучок обеспечивается суперлюминесцентным диодом непрерывного действия 1310 нм. Длина волны импульсного возбуждения 266 нм в первую очередь нацелена на пик оптического поглощения ДНК. В результате термоупругого расширения при поглощении импульса внутри ядер клеток увеличиваются показатели начального фотоакустического давления. Эти показатели могут модулировать локальные оптические свойства посредством упруго-оптического эффекта, что создает области возмущений, наблюдаемые с помощью зондирующего пучка.
Рисунок 1. Схема устройства для дистанционного фотоакустического зондирования. Обозначения компонентов: светоделитель (BS), коллиматорный прицел (ZC), фильтр длинных частот (LP), поляризационный светоделитель (PBS), четвертьволновая пластина (QWP), дихроичное зеркало (DC), сбалансированный фотодиод (BPD), точечное отверстие (PH), фильтр нейтральной плотности (NDF), зеркала гальванометра (GM), объектив (OL). Лазер с длиной волны 266 нм (SNU-20F-10x, Teem Photonics) пространственно фильтровался с помощью двух объективов (LA4052-UV и LA4380-UV, Thorlabs Inc.) и точечного отверстия 25 мкм (P25C, Thorlabs Inc.). Затем пучок был расширен с помощью расширителя пучка с фиксированным увеличением (BE05-266, Thorlabs Inc.). Далее было проведено объединение с путем обнаружения, в котором используется непрерывный суперлюминесцентный диод с длиной волны 1310 нм (S5FC1018P. Thorlabs Inc.) в качестве источника света. Пучок с длиной волны излучения 1310 нм был пропущен через контроллер поляризации (FPC562, Thorlabs Inc.), а затем коллимирован (RC04APC-P01, Thorlabs Inc.). Далее коллимированный зондирующий пучок был расширен с помощью расширителя пучка с регулируемой яркостью (BE02-05-C, Thorlabs Inc.). Поляризационный светоделитель (CCM1-PBS254, Thorlabs Inc.) расщепил пучок исходя из состояния поляризации. Горизонтально поляризованный свет преобразовался в свет с круговой поляризацией с помощью четвертьволновой пластины нулевого порядка (WPQ10M-1310, Thorlabs Inc.). Дихроичное зеркало (HBSY234, Thorlabs Inc.) было использовано для объединения зондирующего и возбуждающего пучков. Зондирующий и возбуждающий пучки были объединены в сканирующей 2D-системе (GVS412, Thorlabs Inc.), затем совместно сфокусированы с помощью отражающего объектива с числовой апертурой 0,3 (LMM-15X-UVV, Thorlabs Inc.). Отраженный зондирующий пучок с круговой поляризацией преобразовался в пучок с горизонтальной поляризацией с помощью четвертьволновой пластины, а затем прошел обратно через поляризационный светоделитель, где был направлен на сбалансированный фотодиод InGAS с полосой пропускания 75 МГц (PDB425C-AC, Thorlabs Inc.) для зондирования. Фильтр длинных частот был выбран таким образом, чтобы блокировать любой отраженный возбуждающий свет
Формирование изображения
Изображения с небольшим полем обзора, шириной менее ~300 мкм, формировались путем оптического сканирования ткани-мишени с использованием 2D системы зеркального гальванометра. Зеркала были установлены под прямым углом друг к другу и поэтому служили для направления пучка в любую точку посредством оптического сканирования в фокальной плоскости через основной объектив. Одно из зеркал использовалось при более высокой частоте, ~30 Гц, в то время как частота, при которой использовалось зеркало для более медленного сканирования, определялась требуемой плотностью точек и частотой повторения импульсов. Например, для точечного сканирования в 400 тыс. точек достаточно частоты 60 МГц. Время измерения зависело исключительно от плотности точек при заданной частоте повторения импульсов, при этом сканирование в 400 точек занимало 18-20 с на кадр.
Сигнал напряжения от сбалансированного фотодиода подавался на 16-разрядный процессор для обработки изображений (CSE161G4, Gage Applied). Сигналы дистанционного фотоакустического зондирования затем извлекались путем взятия огибающей записанных сигналов во временной области, указывающей на модуляции оптических характеристик образца, создаваемые дистанционным фотоакустическим зондированием. Изображения формировались путем взятия проекции максимальной амплитуды в каждой точке, образуя en-face проекцию, отображаемую на развертке типа С. Данные о положении от сканирующих зеркал также собирались и усреднялись для повышения точности.
Изображения, полученные с помощью зеркального сканирования, формировали основу для изображений, полученных с помощью мозаичного и объемного сканирований, описанных в статье, и служили режимом визуализации, позволявшим увеличить интересующую область изображения с большим полем обзора. Для получения изображений с большим полем обзора сканирующие зеркала удерживались неподвижно, а образец перемещался с помощью механических блоков под объективом. Обратная связь по положению фиксировалась для восстановления. Такой режим визуализации обеспечивает практически неограниченное поле обзора, при этом основными ограничениями являются плотность точек и время исследования. Например, параметры больших изображений составляли ~ 10 × 10 мм с разрешением 4 мкм, при этом время получения составляло около 7 минут.
Исследование разрешения
Разрешение системы было определено на основе B-скана углеродного волокна. Боковое и осевое разрешение измерялись путем сопоставления необработанных данных B-скана с передаточными функциями сканирующей системы на границе «черной» и «белой» областей изображения. Разрешение определялось как ширина от 10% до 90% этой функции, как показано на рисунке 2. Установлено, что поперечное разрешение системы составляет 1,2 мкм, тогда как осевое разрешение составляет 7,3 мкм. Такие параметры сопоставимы с разрешением коммерческих светлопольных микроскопов, используемых в патологоанатомических исследованиях и работающих с объективами, обеспечивающими увеличение от 5 до 40 раз, что дает субмикронное разрешение.
Рисунок 2. Исследование разрешения на основе сканирования углеродного волокна диаметром 7 мкм в воде. (а) B-скан углеродного волокна. На двух правых графиках продемонстрировано извлечение данных бокового и осевого разрешения из передаточных функций сканирующей системы на границе «черной» и «белой» областей изображения углеродного волокна (i) и (ii) соответственно. Шкала 10 мкм
Характеристика чувствительности
Значения соотношения сигнал/шум (SNR) определяются путем предварительного описания системного шума. Шум (σn) характеризуется как стандартное отклонение всех значений пикселей в пустых кадрах. Затем были выполнены измерения соотношения сигнал/шум с использованием двух метрик. Пиковое (SNRp) и среднее (SNRm) значения соотношения сигнал/шум считаются по формулам,
где sij — сигнал на изображении, 〈〉— среднее значение, а t — некоторое пороговое значение, используемое для обозначения уровня сигнала. В образцах тканей это максимальное значение, при котором происходит восстановление структуры клеточного ядра. Извлеченные значения соотношения сигнал/шум составляют SNRp = 58,45 дБ и SNR m = 41,98дБ.
Приготовление образцов
Образцы тканей молочной железы, миндалин, желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы человека были получены в соответствии с протоколом, одобренным Этическим советом по исследованиям в здравоохранении провинции Альберта (Идентификатор протокола: HREBA.CC-18-0277) и Комитетом по этике медицинских исследований Университета Ватерлоо. Образцы ткани молочной железы были получены после недавно проведенных резекций и немедленно помещены в формальдегид для обеспечения надлежащей фиксации ткани. Ткань поджелудочной железы и ткань после резекции миндалин были получены из сохраненных образцов, которые были приготовлены аналогичным образом.
Для сравнения изображения, полученного с помощью дистанционного фотоакустического зондирования, и изображения ткани, окрашенной Г&Э, были сделаны два последовательных среза с одного FFPE-блока. Поскольку срезы не были идентичны, наблюдались некоторые незначительные различия во внешнем виде. Далее описан способ приготовления FFPE-блоков, неокрашенных микропрепаратов и микропрепаратов, окрашенных Г&Э.
FFPE-блоки
После помещения в формальдегид в течение не менее 48 часов ткани обрабатывали стандартным способом: обезвоживали, очищали ксилолом и пропитывали горячим парафином. После этого ткань была залита парафином и закреплена на кассетах. После охлаждения до комнатной температуры приготовление FFPE-блоков было завершено. Затем нужно было сделать срезы с FFPE-блока с помощью микротома. Срез материала проводился до тех пор, пока не обнажалась желаемая область ткани-мишени. Ткань желудочно-кишечного тракта была получена из сохраненных FFPE-образцов, которые первоначально были приготовлены аналогичным образом.
Приготовление неокрашенных микропрепаратов
Срезы ткани толщиной 4 мкм с FFPE-образцов были сделаны и помещены на теплую водяную баню. Затем срезы перенесли на предметные стекла и нагревали при температуре 60°C в течение 1 часа, чтобы удалить избыток парафина. Срезы не были покрыты покровными стеклами или какими-либо другими средами.
Приготовление срезов, окрашенных Г&Э
Срезы ткани толщиной 4 мкм с FFPE-образцов были сделаны и помещены на теплую водяную баню. Затем срезы перенесли на предметные стекла и нагревали при температуре 60°C в течение 30 минут, после чего окрасили Г&Э перед нанесением заключающей среды для микропрепаратов и покровного стекла. Как только заключающая среда высохла, срезы были готовы к использованию.
Характеристики системы
Результаты получены с помощью устройства, продемонстрированного на рисунке 1. Наносекундный импульс излучения 266 нм использовался для возбуждения фотоакустического давления внутри образца, обеспечивающего контраст ДНК. Фотоакустическое давление обнаруживалось путем мониторинга интенсивности отражения от совместно сфокусированного непрерывного источника возбуждения 1310 нм. Мишени состояли из углеродных волокон диаметром 7 мкм (рисунок 3а) и образца раковой опухоли молочной железы (инвазивная протоковая карцинома) (рисунок 3b). Все изображения получены безмаркерным способом и с эндогенным контрастом. Все представленные изображения, полученные с помощью дистанционного фотоакустического зондирования, были извлечены на большом рабочем расстоянии от объектива (24 мм), что позволяет использовать систему как в качестве настольного устройства, так и в качестве инструмента in-situ, где рабочее пространство ограничено. При текущей частоте повторения импульсов 20 кГц снимки с малым полем обзора (высокое разрешение) были получены при плотности точек 2 пикселя/мкм и скорости 1250/с. Показатели разрешения извлекались из структурных изображений с помощью передаточных функций сканирующей системы на границе «черной» и «белой» областей изображения по B-сканам углеродных волокон толщиной 7 мкм. Установлено, что поперечное разрешение системы составило 1,2 мкм, тогда как осевое разрешение составило 7,3 мкм. Значения соотношения сигнал/шум были получены на основе описания системного шума путем отображения пустых кадров, а затем сравнения с сигналами дистанционного фотоакустического зондирования. Таким образом, были получены пиковое и среднее значения соотношения сигнал/шум SNR p = 58,5 дБ и SNR m = 42 дБ соответственно для неокрашенных микропрепаратов (рисунок 3b). Более подробная информация об этих измерениях приведена в разделе «Методы».
Рисунок 3. (а) Изображение углеродных волокон толщиной 7 мкм, полученное с помощью дистанционного фотоакустического зондирования. (b) Изображения неокрашенного образца ткани молочной железы, установленного на предметном стекле, полученные с помощью дистанционного фотоакустического зондирования. Шкала для (a,b) 50 мкм
Результаты исследований изображения, полученные с помощью дистанционного фотоакустического зондирования, будут представлены в следующей статье.
© Thorlabs
Компания INSCIENCE помогает своим заказчикам решать любые вопросы и потребности по поставке оборудования Thorlabs на территории РФ
В работе предлагается технология производства источников неразличимых фотонов в телекоммуникационном С-диапазоне на основе эпитаксиальных полупроводниковых квантовых точек. Новая методика позволяет детерминировано интегрировать квантовые излучатели в микрорезонаторы из кольцевых брэгговских решёток.
В статье описывается адаптация научной КМОП камеры Tucsen с обратной засветкой с целью улучшения возможностей регистрации когерентного рассеяния мягкого рентгеновского излучения.
В работе представлено два возможных варианта использования источников суперконтинуума: в качестве источника зондирующего излучения для оптической когерентной томографии и в качестве источника возбуждения для флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии.
В работе реализован протокол BB84 с твердотельным источником одиночных фотонов на основе атомарно тонких слоев WSe2, выделяющийся простотой изготовления и настройки свойств. Система конкурентоспособна в сравнении с передовыми решениями, а с внедрением улучшений в виде микрорезонаторов может превзойти их.
В статье описывается метод широкопольной квантовой микроскопии с пространственным разрешением 1,4 мкм, основанный на схеме с симметричными плечами холостых и сигнальных фотонов. Преимущества метода: высокие скорость, отношение сигнал/шум и устойчивость к рассеянному свету в сравнении с аналогичными методами квантовой визуализации.
г. Санкт-Петербург, улица Савушкина 83, корп. 3
