Генераторы суперконтинуума для задач оптической когерентной томографии и флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии

Введение

Оптическая когерентная томография (ОКТ) основана на интерферометрии широкополосного излучения для неинвазивного трёхмерного зондирования биологических тканей. Такие томографы построены на основе сканирующего интерферометра Майкельсона, а в качестве источника зондирующего излучения используется высокоинтенсивный источник широкополосного излучения с низкой временной когерентностью, как правило, это суперлюминесцентный диод, либо лазерный генератор суперконтинуума.

Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS) предназначена для измерения диффузных и молекулярных взаимодействий при наномолярной концентрации веществ в биологических системах. Когда флуоресцентно меченые молекулы диффундируют в исследуемой области, регистрируется ряд флуктуирующих флуоресцентных сигналов, которые коррелируются по нескольким спектральным каналам с использованием высокочувствительного CCD сенсора.

Оптическая когерентная томография

Учеными Датского технического университета впервые представлена установка спектральной оптической когерентной томографии на основе источника суперконтинуума (SD-OCT) с ограниченным дробовым шумом и осевым разрешением 5,9 мкм при центральной длине волны зондирующего излучения 1370 нм.

Источник суперконтинуума на основе волокна длиной 10 м с полностью нормальной дисперсией (кварцевое волокно, легированное GeO2 с профилем типа ANDi производства OFS Denmark), накачивался фемтосекундным лазером 1550 нм с длительностью импульсов 125 фс (Toptica: Femto fiber). Излучение суперконтинуума генерируется в диапазоне 1280-1910 нм, спектр обрезается двумя фильтрами (Thorlabs: FELH1000 и DMSP1500) до полосы 1000-1500 нм. Рабочая частота следования импульсов источника суперконтинуума ~90 МГц.

Сканирующий интерферометр собран на базе волоконного светоделителя 50:50 (Thorlabs: TW1300R5A2) с подвижным зеркалом в плече опорного канала и гальванометрическим сканатором (Thorlabs: GVS002) в плече сигнального канала образца (рисунок 1). В качестве спектрально-селективного фотоприемника используется спектрометр (Wasatch Photonics: C-1070-1470-GL2KL), работающий в диапазоне 1074-1478 нм с разрешением 0,2 нм.

Рисунок 1 – Схема экспериментальной установки ОКТ

Для сравнения качества работы системы также задействованы два типовых референтных источников суперконтинуума с частотой повторения импульсов 80 МГц (NKT Photonics: SuperK EXTREME EXW-12) и 320 МГц (NKT Photonics: SuperK EXTREME EXR-9 OCT).

Результаты исследований показали, что источник суперконтинуума на ANDi волокне обеспечил гораздо лучшее соотношение сигнал-шум в системе ОКТ. Качество A-скана (по уровню дисперсии) улучшилось для всех оптических разностей хода (OPD) примерно на 13 дБ по сравнению с источником SuperK 80 МГц и на 9 дБ по сравнению с SuperK 320 МГц. Качество B-скана было также значительно улучшено (рисунок 2). Общая чувствительность экспериментальной установки составила 96 дБ, потенциально возможная чувствительность при переходе на зондирующее излучение на длине волны 800 нм – 114 дБ.

Рисунок 2 – Томограмма сетчатки глаза крысы, B-сканы, полученные с помощью серийно выпускаемых источников суперконтинуума NKT SuperK (a, c) и источника ANDi SC (b).

Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS)

Традиционно системы FCCS ограничиваются наблюдением за различными флуорофорами, которые хорошо разделены по спектральным полосам, чтобы минимизировать перекрытие флуоресцентного излучения в соседних каналах. Чтобы преодолеть спектральные перекрестные помехи, коллективом американских ученых разработан метод импульсного чередующегося возбуждения (PIE) FCCS, в котором возбуждение и обнаружение каждого флуорофора происходит в уникальные временные точки. Продемонстрировано, что FCCS может разрешить до четырех спектрально перекрывающихся флуорофоров для изучения их подвижности и кластерных взаимодействий с одним источником возбуждения и одним детектором.

В качестве исследуемых образцов используются флуоресцентные наносферы Fluoro-Max (Fisher Scientific). Четырехканальная FCCS система реализована на базе инвертированного микроскопа (IX71, Olympus) на виброизолированном оптическом столе. Возбуждение флуоресценции осуществляется лазерным источником суперконтинуума (SC-Pro, YSL photonics) с диапазоном излучения 400-2400 нм, длинноволновая составляющая (>650 нм) отделена дихроичным зеркалом. Оптические каналы разделены дихроичными зеркалами и фильтрами (BrightLine FF02-435/40, FF01-513/13, FF01-561/14 и FF01-630/38, Semrock), пучки расширены, ослаблены и рекомбинированы. Средняя оптическая мощность на канал ~10 мкВт.

Каналы объединяются с помощью системы дихроматических зеркал (ZT442/514/561rpc, Chroma), затем излучение направляется в объектив микроскопа 40x, 1,30 NA (UIS2 BFP1, Olympus) и фокусируется на образце (рисунок 3). Излучение от исследуемого образца собирается тем же объективом, проходит через трехполосное дихроичное зеркало и систему фильтров (ZET442/514/561m, Chroma) и фокусируется тубусной линзой микроскопа на конфокальное отверстие диаметром 40 мкм (P40D, Thorlabs). Далее излучение поступает в систему спектральной сепарации, образованной релейной линзой (Optomask, Andor), и диспергирующей призмой (PS812-A, Thorlabs). Регистрация осуществляется EMCCD камерой (iXon Ultra 897, Andor) и sCMOS камерой (Zyla, Andor). Спектральное разрешение установки составляет 16 нм на пиксель для EMCCD и 6,6 нм на пиксель для sCMOS камеры.

Рисунок 3 – Схема экспериментальной установки FCCS

Каждое изображение усредняется по нескольким кадрам, ориентированным перпендикулярно хроматическому разделению, чтобы локализировать излучение от всех флуорофоров в определенный момент времени. Эти спектральные данные анализируются для извлечения относительных изменений концентрации каждого флуорофора в пятне наблюдения в зависимости от времени.

Результатом исследования стала возможность определения диффузии и агрегации флуоресцентных наночастиц в водных суспензиях. Четыре различных типа полистирольных наночастиц измерялись с пиковыми длинами волн возбуждения 450, 515, 561 или 635 нм (B 450, B 515, B 561 или B 635 ). При увеличении солености раствора путем добавления PBS, наночастицы случайным образом связывались вместе, поскольку соли способствовали агрегации. Четыре интенсивности в зависимости от времени показали множество коррелированных пиков, подтверждающих образование больших разноцветных кластеров наночастиц (рисунок 4). Чувствительность как EMCCD, так и sCMOS камеры оказалась достаточной для проведения измерений.

Рисунок 4 – FCCS на четырех спектрально перекрывающихся флуоресцентных наночастицах. Флуктуации интенсивности в зависимости от времени для четырех типов наночастиц (B450, B515, B561, B635) в свободном (а) и связном солевым раствором (b) состояниях. Графики авто- и кросс-корреляционного анализа для частиц в свободном (b; c) и связном состояниях (e, f)

Источники: Sonali A. Gandhi, Matthew A. Sanders, James G. Granneman, and Christopher V. Kelly, "Four-color fluorescence cross-correlation spectroscopy with one laser and one camera," Biomed. Opt. Express 14, 3812-3827 (2023).

Rao D. S., S., Jensen, M., Grüner-Nielsen, L. et al. Shot-noise limited, supercontinuum-based optical coherence tomography. Light Sci Appl 10, 133 (2021).

Компания INSCIENCE занимается поставками оборудования для оптической когерентной томографии и флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии, а также источников суперконтинуума для широкого круга экспериментальных задач.