Сравнение гиперспектральных микроскопов когерентного комбинационного рассеяния для биомедицинских применений

Визуализация без меток на основе колебательной спектроскопии представляет собой мощный метод исследования пространственного распределения различных молекул в сложных образцах, особенно биомедицинских. Основным преимуществом является возможность визуализации не только морфологии, но и молекулярного состава и функции. Существующие в настоящее время методы визуализации колебаний основаны на комбинационном рассеянии и ИК-поглощении, которые, однако, не подходят для визуализации биологических тканей в реальном времени. Спонтанное комбинационное рассеяние страдает от длительного времени регистрации в диапазоне секунд и частого появления сильного фона флуоресценции. ИК-изображение ограничено поглощением воды и низким пространственным разрешением, хотя последние наработки позволили улучшить пространственное разрешение. В качестве альтернативы используется визуализация когерентного комбинационного рассеяния (CRS), но наиболее быстрые реализации основаны на визуализации распределения только одного колебательного комбинационного резонанса, а не всего или значительной части колебательного спектра, тем самым значительно снижается информативность. Это связано с тем, что информация об изменениях формы спектра или сдвиге положения пика не может быть извлечена из нескольких изображений, а требует спектральной информации. Чтобы преодолеть это ограничение, можно использовать мультиплексное CRS или гиперспектральную когерентную рамановскую визуализацию. Мультиплексное CRS концептуально очень похоже на спонтанную рамановскую спектроскопию, требующую спектрографов и ПЗС детекторов для сбора и обработки данных. Однако время сбора данных значительно сокращается, до мс. Более быстрое сканирование может быть реализовано только с помощью гиперспектрального CRS. Здесь отдельные изображения получают в выбранных спектральных позициях, а лазерный источник перестраивается между ними при записи изображений. В качестве третьего подхода было использовано одновременное обнаружение части спектра в области растяжения СН с помощью массива настроенных усилителей (TAMP) и модулированных широкополосных лазеров. Последние два метода позволяют осуществлять спектральное сканирование с временем интеграции в мкс. Таким образом, гиперспектральное CRS на сегодняшний день представляет собой самый быстрый метод вибрационной визуализации, но до сих пор было мало работ по спектральной обработке данных гиперспектрального CRS.

В настоящее время известны два метода CRS: когерентное антистоксово комбинационное рассеяние (CARS) и стимулированное комбинационное рассеяние (SRS). В мультиплексном CRS до сих пор применялось в основном CARS, в то время как SRS может быть предпочтительнее в гиперспектральной визуализации. Это будет объяснено ниже на основе Таблицы 1, в которой представлены различные свойства CARS и SRS.

Таблица 1. Сравнение свойств стимулированного комбинационного рассеяния (SRS) и когерентного антистоксова комбинационного рассеяния (CARS)

Из таблицы 1 видно, что SRS имеет преимущества в плане молекулярного контраста и количественной оценки по сравнению с CARS. В частности, SRS линейно зависит от концентрации аналита, а форма спектральных линий аналогична спонтанному комбинационному рассеянию, поэтому базы спектральных данных, созданные для данных спонтанного комбинационного рассеяния, могут быть непосредственно использованы для SRS. Благодаря линейной зависимости от концентрации, SRS более чувствителен к разбавленным аналитам, что позволяет обнаруживать молекулярные маркеры при более низких концентрациях по сравнению с CARS. Напротив, интерференция сигнала CARS с NRB (нерезонансный фон) приводит к искажению формы спектральной линии и смещению положения пика, что требует сложных алгоритмов типа Крамерса-Кронига или максимальной энтропии и дорогостоящих расчетов для извлечения спектра спонтанного комбинационного рассеяния. Однако внедрение CARS в стандартные лазерные сканирующие микроскопы является более распространенным, поскольку не требуется ни лазерная модуляция одного из лазеров, ни специальные детекторы и сложные частотно-селективные усилители, такие как усилители с блокировкой (LIA) или перестраиваемые усилители (TAMP). Кроме того, пространственное разрешение CARS-микроскопии потенциально выше благодаря нелинейной зависимости более высокого порядка от интенсивности возбуждающего лазера, и схемы визуализации с высоким разрешением представляются возможными.

Анализ многоспектральных рамановских данных биологических образцов требует сложного анализа данных, независимо от того, используется ли спонтанное или когерентное рамановское рассеяние. Это связано с тем, что различия в концентрации маркерных молекул, таких как белок, ДНК и липиды, довольно малы для разных типов тканей. Поэтому необходимы соответствующие шаги по предварительной обработке спектра для коррекции фоновых сигналов и других световых ошибок. В приведенном исследовании были записаны данные гиперспектрального CARS и SRS для образцов тканей головы и шеи, затем наборы данных проанализированы с помощью подходов мультиспектрального анализа, позже было проведено сравнение результатов.

Для анализа была использована биопсия дна полости рта в рамках операции на голове и шее. Ткань состояла из мышц, жира и желез (рис. 1). Ткань была проанализирована с помощью CARS и SRS в спектральной области растяжения CH от 2650 до 3100 см^-1.

Рисунок 1. Обзор участка ткани. На фигуре (a) показано обзорное CARS-изображение участка ткани головы и шеи человека в области симметричных алифатических CH-растягивающих колебаний метиленовых групп CH₂ при 2850 см^-1. Изображение на фигуре (а) было получено путем объединения отдельных изображений и было сравнено с белым изображением исследуемого участка ткани, показанным на фигуре (b). Белая область в левом нижнем углу фигуры (а) увеличена на фигуре (в). Изображения в белом свете были получены с помощью микроскопа Zeiss Axiovert 200M и объектива 10× (Plan-Apo, Zeiss, Германия). Участок состоит из железистой (синяя линия), мышечной (желтая линия) и жировой ткани (зеленая линия). На фигурах (c) и (d) представлены CARS-изображения в белом свете, отмеченные в левом нижнем углу фигуры (a). Эта область была исследована с помощью гиперспектральной CRS. CARS-изображения были получены с использованием 23 мВт мощности накачки и 24 мВт мощности Стокса на образце

Эксперименты по когерентной рамановской визуализации проводились с использованием компактного оптического параметрического генератора с накачкой волоконным лазером (OPO, picoEmerald S, APE, Берлин, Германия). OPO накачивается второй гармоникой Yb-волоконного лазера, излучающего импульсы с частотой повторения импульсов 80 МГц, длительностью 2 пс и центральной длиной волны 1032 нм. Этот лазер также использовался в качестве пучка Стокса в экспериментах по визуализации. OPO генерировал сигнал средней мощностью приблизительно >500 мВт ( 750-960 нм) и >400 мВт (1150-1350 нм) соответственно путем параметрического преобразования. При длине волны сигнала около 800 нм, как использовалось в данных экспериментах, лазер обеспечивает выходную мощность 900 мВт. Сигнал перестраивается от 700 до 960 нм и используется в экспериментах по получению изображений CRS в качестве пучка накачки, что позволяет получить изображения CRS от 720 до 4500 см^-1. Лазер обеспечивает электронное управление перекрытием импульсов, перестройку длины волны и компенсацию расхождения пучков накачки и Стокса, возникающего из-за оптики микроскопа, с помощью каскада задержки. Встроенный электрооптический модулятор модулирует Yb-лазер на частоте 20 МГц для SRS. Для визуализации CRS лазер был подключен к самодельному лазерному сканирующему микроскопу, оснащенному 20× микроскопическим объективом (20× NIR Apo, NA = 0,4, Mitutoyo, Япония) для визуализации образца с использованием мощности лазера 47 мВт на образце. Сигналы CARS и SRS регистрируются в прямом направлении. Дихроичный длинноволновый делитель луча на 735 нм (Semrock, США) разделяет сигналы SRS и CARS. Сигнал CARS дополнительно фильтруется от остаточного лазерного излучения с помощью коротковолнового фильтра 770 нм (Semrock, США) и полосового фильтра 650 нм (Thorlabs, США). Для обнаружения SRS два коротковолновых фильтра (1000 нм Thorlabs, США, 1010 нм, Semrock, США) помещаются перед Si-фотодиодом большой площади (10 мм²), подключенным к быстрому аналоговому LIA (APE, Берлин, Германия). LIA работает в диапазоне частот модуляции от 8 до 20 МГц, обеспечивая усиление от -4,5 до 43,5 дБ и дополнительное пост-усиление 12 дБ при временных константах вплоть до 100 нс.

Для проведения экспериментов по получению изображений с помощью CRS, замороженный участок ткани головы и шеи человека был исследован с помощью микроскопии белым светом и CRS в спектральной области CH-растяжения, как показано на рис. 1. На рис. 1(a) обзорное, а на рис. 1(c) детальное CARS-изображение симметричного алифатического CH-растяжения метиленовых групп CH₂ при 2850 см^-1 сравниваются с микроскопическими изображениями той же области, представленными на рис. 1(b) и 1(d). Область, показанная на рис. 1(c) и 1(d), была исследована путем одновременного обнаружения гиперспектральных CARS и SRS от 2650 см^-1 до 3100 см^-1 путем перестройки лазера накачки от 782 нм до 810 нм с шагом в 1 нм. Этот шаг соответствует приблизительно 15 см^-1. Для формирования изображения на образце использовали 23 мВт мощности лазера накачки и 24 мВт мощности стоксова лазера. Область, показанная на рис. 1(c), 2 и 3, состоит из железистой, жировой и мышечной тканей, как указано. Анализ данных на стеках гиперспектральных изображений проводился с использованием свободной среды программирования R. Применяемый конвейер анализа начинался с импорта соответствующих изображений в R и переупорядочивания стеков данных SRS и CARS. Оба стека изображений (CARS, SRS) включали 25 измерительных каналов. Каждое изображение стека изображений подвергалось медианной фильтрации с размером окна 5. После этого стеки объединялись, применялся анализ главных компонент (PCA), основанный на уменьшении размеров, и проводился кластерный анализ k-means с использованием PC-оценок объединенных данных. Свободный параметр k был установлен на 7 для того, чтобы восстановить обзор тканевых структур. Спектры CARS и SRS в соответствующей стопке также были векторно нормализованы и затем объединены. Тот же кластерный анализ k-means был выполнен с k = 7 для объединения нормализованных данных. Для ускорения оптимизации k-means при сохранении оптимума, авторы использовали сокращение размерности только на 8 PC-коэффициентов. Это измерение PC учитывало 99,65% (необработанные и комбинированные данные), 96,72% (нормализованные и комбинированные данные), 99,85% (нормализованные данные CARS) и 95,77% (нормализованные данные SRS) совокупной дисперсии в соответствующем стеке данных.

Рисунок 2. Результат кластерного анализа для объединенных данных SRS-CARS. Объединенный стек данных SRS-CARS был использован для кластерного анализа по методу k-means. Распределение кластеров на основе ненормированных данных показано на (a), а соответствующие средние спектры визуализированы на (b). Аналогичным образом на фигуре (c) показано распределение кластеров при кластерном анализе k-means нормализованных спектров с соответствующими средними спектрами (d). На фигурах (a) и (c) указаны различные типы тканей в пределах участка: железистые (синяя область справа), мышечные (желтая область в центре) и жировые ткани (красная область слева). В случае (а) кластеры не представляют типы тканей. Нормализация улучшает классификацию различных типов тканей, как видно из фигуры (в). В целом, распределение сигналов CARS и SRS не является ко-локализованным. Это видно, так как средние кластерные спектры не показывают аналогичного поведения в части CARS и SRS. Масштабная линейка 100 мкм

Рисунок 3. Результат кластерного анализа отдельно для данных SRS и CARS. Стек данных CARS-SRS был отдельно проанализирован с помощью кластерного анализа k-means. Кластерное распределение на основе нормализованных данных CARS показано на (а), а кластерное распределение нормализованных данных SRS показано на (в). На фигурах (a) и (c) указаны различные типы тканей в пределах участка: железистая (синяя область справа), мышечная (желтая область в центре) и жировая ткани (красная область слева). Соответствующие средние спектры показаны на фигурах (b) и (d). Несмотря на то, что все кластерные средние показывают различные вклады в области волновых чисел, распределение кластеров может быть использовано для целей визуализации в обоих случаях (SRS и CARS), поскольку одни и те же тканевые структуры (железистая, мышечная и жировая ткани) видны и различимы на обоих графиках (a/c). Масштабная линейка 100 мкм

На рис. 2 показаны результаты кластерного анализа, проведенного для объединенных стеков данных SRS-CARS, для нормализованных и ненормализованных данных. На рис. 2(a) и 2(c) показано распределение кластеров, а на фигурах (b) и (d) визуализированы соответствующие средние спектры кластеров, которые состоят из спектральной части CARS и спектральной части SRS. Таким образом, можно интерпретировать локальные различия между спектрами CARS и SRS с точки зрения формы спектра и положения пика. На рис. 2(b) показаны средние спектры 7 кластеров. Очевидно, что области с наибольшей интенсивностью CARS не соответствуют областям с наибольшими сигналами SRS; следовательно, сигналы CARS и SRS не локализованы. Кластер 5 характеризуется наибольшим сигналом CARS, в то время как наибольший сигнал SRS находится в кластере 2. Этот вывод на ненормированных данных объясняется тем, что интенсивность сигнала CARS и интенсивность сигнала SRS имеют различные зависимости от концентрации, как показано в Таблице 1. CARS фокусируется на высококонцентрированных видах из-за нелинейной зависимости от концентрации, в то время как SRS имеет линейную зависимость от концентрации. Однако играют роль и другие эффекты, например, сбор сигналов SRS и CARS различается из-за разных длин волн сигнала. Чтобы исключить такие различия в фокусировке CARS и SRS, нормализованные данные были проанализированы таким же образом, что привело к аналогичному выводу: спектры SRS и CARS одних и тех же участков ткани не идентичны. Также хорошо видно, что упорядочение интенсивности пиков сигналов различается для средних спектров CARS и SRS 7 кластеров. Из-за линейной зависимости от концентрации SRS более чувствителен к молекулам в более низкой концентрации, в то время как CARS обеспечивает лучшую дискриминацию обильных молекул и выделяет области с высокой концентрацией. Однако без нормализации можно извлечь очень мало информации о различных тканевых структурах. Кластер 7 ненормализованных данных в основном соответствует не только фоновым областям, т.е. пустотам в ткани, но и областям общей низкой концентрации. Остальные кластеры хорошо перемешаны и не коррелируют с конкретными структурами, например, адипоцитами, мышечными пучками и железистой тканью (рис. 2(a)).

Это связано с тем, что кластерное распределение ненормализованных данных сильно зависит от абсолютной интенсивности сигнала, которая изменяется в зависимости от толщины ткани и эффективности обнаружения, а не от изменений в составе. Поэтому тот же анализ был проведен для нормализованных данных SRS и CARS. Результаты представлены на рис. 2(c) и 2(d). Очевидно, что распределение кластеров отличается при использовании нормализованных и ненормализованных данных. После нормализации два кластера 3 и 6 представляют фоновые области, но доля площади этих кластеров меньше, чем у кластера 7 на рис. 2(a). Кроме того, другие кластеры по сравнению с рис. 2(а) в большей степени коррелируют с конкретными тканевыми структурами, например, кластер 5 соответствует ткани адипоцитов и характеризуется наибольшей интенсивностью CARS-сигнала. Кластер 4 и части кластеров 1 и 2 в основном соответствуют мышечным пучкам, а кластеры 1 и 7 — железистой ткани. Однако и для нормализованных данных CRS порядок относительной интенсивности CARS и SRS для 7 кластеров различается. Это может привести к худшему разделению тканевых структур, поскольку кластеризация также основана на различиях в нормализованной спектральной интенсивности и положении пиков, которые различны для CARS и SRS.

Для того чтобы использовать информационное содержание в SRS и CARS-стеках, кластерный анализ для обоих стеков был выполнен отдельно с использованием только нормализованных данных, чтобы выяснить, можно ли улучшить характеристику тканей по сравнению с комбинированной гиперспектральной CARS и SRS визуализацией. Кроме того, эффективность обоих методов для определения характеристик тканей исследовалась по отдельности.

Результаты представлены на рис. 3. На рис. 3(a) и 3(b) показаны распределение кластеров и средние спектры кластеров гиперспектрального CARS-изображения, а на фигурах (c) и (d) — распределение кластеров и средние спектры спектральной части SRS. Как очевидно при сравнении рис. 2(a) и 2(c) с рис. 3(a) и 3(c), использование SRS или CARS по отдельности улучшает дискриминацию железистых, жировых и мышечных тканей. Кластер 7 на рис. 3(а) соответствует адипоцитам и характеризуется наибольшей интенсивностью CARS при 2850 см^-1, в то время как кластеры 1 и 2 соответствуют мышечным волокнам, которые спектрально характеризуются сходной интенсивностью CARS при 2850 и 2930 см^-1. Кластер 3 с низкими спектральными различиями представляет фон, а остальные кластеры с 4 по 6 более многочисленны в железистой ткани. По сравнению с рис. 2(c), характеристика ткани значительно улучшается при использовании только нормализованных спектров CARS. На рис. 3(c) тот же анализ был проведен для гиперспектральных данных SRS. Здесь кластеры 4 и 5 характеризуются средними спектрами с наибольшей интенсивностью сигнала около 2960 см^-1, специфически выделяя мышечные волокна, в то время как кластеры 1 и 3 характеризуются дополнительным пиком при 2850 см^-1, характерным для групп CH₂ в адипоцитах. Железистая ткань в основном относится к кластерам 4 и 5, аналогично мышечной ткани. При сравнении результатов кластеризации CARS и SRS отдельно на рис. 3(a) и 3(c) очевидны некоторые различия: во-первых, кластеры, полученные на основе гиперспектральных данных CARS, более однородны, что позволяет четко дифференцировать жировую, мышечную и железистую ткани. Во-вторых, CARS особенно чувствителен к структурам, богатым липидами, таким как адипоциты, благодаря квадратичной зависимости концентрации от рассеивающей функциональной группы CH₂. С другой стороны, при сравнении рис. 3(b) и 3(d) SRS дает больше спектральных различий, но кластеризация различных типов тканей несколько хуже. Этот вывод можно объяснить тем, что концентрационная зависимость сигналов CARS и SRS различна; следовательно, распределение кластеров и средние спектры не совпадают.

В целом, CARS и SRS подходят для определения характеристик тканей с помощью гиперспектральной когерентной рамановской визуализации в сочетании с обработкой данных. Объединение гиперспектральных данных CARS и SRS в один стек данных не улучшает результаты кластеризации из-за различий в зависимости от концентрации и положения спектрального пика. Кластерный анализ на основе ненормированных данных показывает, что абсолютный сигнал является доминирующим фактором для характеристики, но нечувствителен к конкретным тканевым структурам. Это связано с тем, что абсолютная интенсивность сигнала сильно зависит от экспериментальных факторов. Следовательно, для улучшения характеристик необходима спектральная предобработка, т.е. векторная нормализация данных. Для нормализованных данных результаты кластеризации для различных тканевых структур улучшаются; однако использование CARS и SRS в комбинации дает худшую характеристику структуры по сравнению с анализом нормализованных данных SRS и CARS по отдельности. Это связано с тем, что зависимость от концентрации, положение пика и спектральный профиль отличаются для CARS и SRS, поэтому интерпретация комбинированных гиперспектральных данных более неоднозначна, чем отдельных гиперспектральных данных. Средние кластерные спектры показывают, что кластеризация данных CARS сильно зависит от симметричного CH-растяжения метиленовых групп при 2850 см^-1, в то время как кластеризация SRS сильно зависит от колебательных полос при 2950 см^-1. Это указывает на то, что CARS очень чувствителен к липидам, в то время как SRS обеспечивает лучшее обнаружение ДНК и белков, которые обнаруживаются при 2930 и 2967 см^-1.

Причиной этого снова является различная зависимость CARS и SRS от концентрации и, кроме того, изменение положения пика из-за интерференции с нерезонансным фоном. Таким образом, модальность визуализации CRS должна быть выбрана в зависимости от вида или молекул, их специфической структуры и диапазона концентраций, представляющих интерес. Таким образом, для концентрированных липидов, например, в липидных каплях, которые состоят из жирных кислот с длинными углеводородными цепями с повторяющимися метиленовыми группами, например, одна молекула пальмитиновой кислоты содержит 14 метиленовых групп, CARS обеспечивает очень высокие сигналы. Кроме того, интеграция CARS-изображений в стандартные платформы широкомасштабного измерения также намного проще, чем в случае SRS: не требуется лазерная модуляция, лазерный шум менее критичен, не нужен блокирующий или настроенный усилитель или дополнительный фотодиодный детектор с большим динамическим диапазоном. Кроме того, CARS обеспечивает более высокое пространственное разрешение благодаря нелинейности более высокого порядка. Однако для молекул в более низких концентрациях и для визуализации менее распространенных функциональных групп SRS более чувствителен. Показано, что для определения характеристик тканей на основе гиперспектральной CRS необходима обработка данных. Концентрации маркерных молекул не извлекаются представленными здесь методами, и семантическая сегментация не проводилась. Тем не менее, было продемонстрировано, что дискриминация конкретных тканевых структур может быть выполнена с помощью SRS и CARS с аналогичным качеством, но оба метода фокусируются на низко- или высококонцентрированных видах, соответственно.

Компания INSCIENCE помогает своим заказчикам решать любые вопросы и потребности
по поставке оборудования на территории РФ