Удаление артефактов рассеяния с формированием шаблона возбуждения обеспечивает быструю широкополосную визуализацию с помощью рассеивающих сред

Аннотация

С помощью нелинейной оптической микроскопии возможно визуализировать глубокие ткани in vivo в миллиметровом масштабе. Ключевой нерешенной проблемой является ограниченная пропускная способность нелинейной оптической микроскопии, особенно по сравнению с методами быстрого широкополосного сканирования, которые повсеместно используются для анализа тонких образцов.

Методы широкополосной визуализации образцов тканей успешно применяются для анализа очищенных тонких тканей, однако, рассеяние фотонов в глубоких мутных образцах существенно ухудшает качество изображения. В статье описан новый метод для решения этой проблемы, представляющий собой удаление артефактов рассеяния с формированием шаблона возбуждения (DEEP), в процессе использования которого применяется шаблон нелинейного возбуждения с последующим использованием вычислительного метода широкополосной визуализации.

Многофотонная временная фокусировка позволяет проецировать шаблоны возбуждения с высоким разрешением на весь образец независимо от его глубины при многократных актах рассеяния благодаря использованию длинноволнового излучения. Вычислительная реконструкция позволяет восстановить структурные элементы с высоким разрешением на основе от десятков до сотен DEEP-изображений вместо миллионов точечных сканирований.

Введение

Точечная сканирующая многофотонная микроскопия (PSMPM) на основе двух- или трехфотонного возбуждения, как правило, используется для объемной визуализации глубоких объектов биологического происхождения in vivo. Ранее ученые визуализировали кортикальную сосудистую сеть в мозге мыши с точностью до 1,6 мм. БИК- или коротковолновые ИК-фемтосекундные лазерные импульсы, используемые в PSMPM, проникают глубоко в ткани благодаря сильной обратной зависимости между рассеянием света и длиной волны.

В PSMPM излучение фокусируется для получения дифракционного предела, обеспечивая эффективное нелинейное возбуждение. Фотоны, как рассеянные, так и не рассеянные, затем собираются точечным детектором, например, трубкой фотоумножителя, и присваиваются 1 пикселю изображения. Несмотря на возможность исследования глубоких образцов, традиционная PSMPM занимает много времени из-за последовательного получения изображений, а время получения изображения линейно масштабируется по мере увеличения глубины, что ограничивает исследование быстрой динамики объекта биологического происхождения.

Альтернативой PSMPM является широкополосная многофотонная микроскопия, так называемая микроскопия с временной фокусировкой (TFM), которая обеспечивает оптическое сечение путем модуляции ширины лазерного импульса при сохранении широкополосного излучения. В TFM широкополосное многофотонное излучение обеспечивается фемтосекундными лазерными импульсами с высокой энергией (~мкДж - МДж).

Решетка размещена на плоскости сопряженного изображения на пути излучения. По мере регулировки дисперсии света ширина лазерного импульса быстро увеличивается, удаляясь от фокальной плоскости, что приводит к снижению эффективности многофотонного излучения. Благодаря большой длине волны возбуждения TFM обеспечивает значительное проникновение многофотонного излучения через рассеивающие среды. При трех-фотонном возбуждении было продемонстрировано проникновение до 700 мкм через рассеивающую ткань мозга.

Однако в TFM излучаемые фотоны с их относительно короткими длинами волн по сравнению с фотонами возбуждения сильно рассеиваются тканями. Поскольку традиционная широкополосная микроскопия регистрирует пространственные данные путем передачи света, излучаемого в плоскости образца, на камеру, соотношение сигнал/шум и пространственное разрешение итогового изображения во многом зависят от рассеяния излучаемых фотонов и аберрации образца ткани.

Следовательно, на TFM-изображениях плоскостей меньшей глубины видно рассеяние фона (рисунок 1B); по мере увеличения глубины TFM-изображения теряют данные с высоким разрешением. Важно, что восприимчивость к рассеянию эмиссионного света и аберрациям является общей для всех методов широкополосной визуализации тканей, в частности, микроскопии плоскостного освещения.

Рисунок 1. Сравнение сценариев двухфотонной визуализации нейрона (256 × 256 × 156 вокселей) у живой мыши. (A) PSMPM-изображение (экспериментальное), (B) TFM-изображение (смоделированное) и (C) DEEP-TFM-реконструкция (смоделированная). В верхнем ряду представлены изображения в проекции XY стеков изображений, в нижнем ряду представлены изображения в проекции XZ. (D) Количество измерений, используемых в каждой плоскости z для PSMPM, TFM и DEEP-TFM. В статье продемонстрирована только длина рассеяния до 2,25 на длине волны излучения, использовалось 128 шаблонов

В данной статье продемонстрирован перспективный подход к удалению артефактов рассеяния на изображениях, полученных с помощью широкополосной TFM. Ранее было предложено множество подходов к вычислительному методу визуализации, которые увеличивают разрешение и контрастность изображения на небольших глубинах (<1 длины рассеяния), однако, большинство из них не применялись для глубокой визуализации.

Примечательно, что некоторые исследователи использовали также TFM совместно с однопиксельной визуализацией (TRAFIX), представляющий собой применение набора двумерных шаблонов возбуждения наряду с однопиксельной визуализацией для получения изображения на глубине до 7 длин рассеяния через рассеивающий фантом биологической ткани. Тем не менее, этот подход требует того же количества шаблонов возбуждения, что и количество пикселей в отображаемом поле обзора, без заметного увеличения скорости по сравнению с PSMPM.

Можно также использовать аналогичный метод компрессионной временной фокусировки 2 фотонов (CS-TFTP), демонстрирующий 10-кратное ускорение по сравнению с PSMPM. Однако как TRAFIX, так и CS-TFTP имеют время захвата, зависящее от поля обзора (FOV), поскольку в них ведется точечная (однопиксельная) визуализация. Таким образом, гипотетическое ускорение по сравнению с PSMPM строго ограничено сжимаемостью изображения. Насколько известно, вычислительный метод TFM пока не применялся совместно с широкополосной визуализацией.

Результаты

Принцип работы DEEP-TFM-микроскопа 

В статье представлен новый вычислительный метод удаления артефактов рассеяния с формированием шаблона возбуждения во время TFM (DEEP-TFM). Подобно предыдущим подходам, в данном исследовании используется двухфотонное смоделированное возбуждение с широкополосной временной фокусировкой, однако сигнал измеряется с помощью широкополосного детектора. В статье описан модифицированный микроскоп собственной разработки с временной фокусировкой, который проецирует произвольные шаблоны возбуждения на фокальную плоскость с помощью цифрового микрозеркального устройства.

Излучаемый свет от модулированного возбуждения затем регистрируется камерой (рисунок 2A). Благодаря длинам волн в БИК-диапазоне шаблоны возбуждения сохраняют свою точность, несмотря на прохождение через рассеивающую среду. Однако фотоны излучения рассеиваются тканями, и сила рассеяния в большинстве тканей биологического происхождения в значительной степени зависит от глубины. На практике TFM-изображения минимально подвержены влиянию рассеяния на поверхности или вблизи нее; по мере увеличения глубины изображения рассеяние постепенно снижает количество высокочастотных данных на изображениях.

Тем не менее, информация о низкой пространственной частоте на изображениях сохраняется для большинства глубин при широкополосной визуализации. Подходы к однопиксельной визуализации не учитывают эти низкочастотные данные, следовательно, для восстановления изображения с удалением артефактов рассеяния требуется большое количество шаблонов возбуждения. В DEEP-TFM информация о шаблонах возбуждения объединяется с полученными изображениями для вычислительной реконструкции изображения с удалением артефактов рассеяния (рисунок 2B).

Экспериментально количество изображений, необходимых для удаления артефактов рассеяния в 1 поле обзора, зависит от потери высокочастотных данных из-за рассеяния и, следовательно, только от глубины изображения. 

Рисунок 2. Экспериментальная установка и стратегия DEEP-TFM-визуализации. (A) Оптическая схема системы формирования изображения: L1, L2, L3, L4 — линзы; DIO — дихроичное зеркало; OBJ — линза объектива; M — зеркало. (B) Предлагаемая стратегия вычислительного метода визуализации. Сначала набор шаблонов проецируется на калибровочный образец (однородный тонкий флуоресцентный слой) для записи набора калибровочных изображений при отсутствии какого-либо рассеяния. После этого те же самые шаблоны проецируются для записи закодированных изображений через рассеивающую среду. Затем изображения, на которых удалены артефакты рассеяния, восстанавливаются

Проверка моделирования с помощью TFM и PSMPM

Эффективность DEEP-TFM была сначала проверена путем сравнения с TFM и PSMPM в ходе моделирования. На рисунке 1А в качестве основы использовался стек изображений нейронов мыши (256 × 256 × 156 вокселей), полученных экспериментально с помощью двухфотонного микроскопа с точечным сканированием. Для этого в PSMPM требуется более 10 миллионов измерений (по одному на каждый воксель).

Затем эталонные данные для каждой плоскости глубины были свернуты с функцией рассеяния точек (sPSF) соответствующей глубины для генерации смоделированных TFM-изображений на рисунке 1B. Традиционная TFM требует только 156 измерений (по одному на каждую плоскость глубины), но качество изображения ухудшается по мере увеличения глубины изображения. Как и ожидалось, на заднем плане можно наблюдать сильное рассеяние, особенно вблизи более ярких областей.

Для получения DEEP-TFM-изображений был сгенерирован набор случайных двоичных шаблонов возбуждения для изображений одинакового размера. Были выбраны случайные шаблоны, поскольку они содержат все частоты, что позволяет осуществлять модуляцию спектра с расширенным диапазоном частот. Затем шаблоны были свернуты с помощью функции распространения волн возбуждения (PSF), помножены по пикселям на эталонные данные по каждой плоскости и свернуты с помощью sPSF соответствующей глубины.

В итоге, смоделированные DEEP-TFM-данные были восстановлены с помощью алгоритма, представленного в разделе "Материалы и методы". Количество шаблонов возбуждения, используемых на разных глубинах, растет по мере увеличения глубины (рисунок 1D). В общей сложности в DEEP-TFM потребовалось 8488 измерений, в то время как в PSMPM было необходимо провести 10,2 миллиона измерений. Как показано на рисунке 1C, в DEEP-TFM можно отбрасывать рассеивающий фон и поддерживать качество изображения, аналогичное PSMPM.

Экспериментальная демонстрация на флуоресцентных микросферах через рассеивающую среду

На рисунке 3A и 3B показаны репрезентативные примеры глубокой TFM-визуализации флуоресцентных микросфер. Сначала была визуализирована смесь микросфер размером 4 и 10 мкм через раствор рассеивающего липида 1,7 мм (0,15%), что соответствует приблизительно двум длинам рассеяния при длине волны излучения 532 нм (все длины рассеяния основаны на длине волны излучения). На рисунке 3A1 показано традиционное TFM-изображение; на рисунке 3A2 показано итоговое DEEP-TFM-изображение  восстановленное с помощью Nt = 128 измерений.

Поскольку свет от всех микросфер проходит через рассеивающую среду одинаковой толщины, ожидалось, что все микросферы размером 4 мкм демонстрируют сходное поведение рассеяния на рисунке 3А1. Как и предполагалось, некоторые микросферы кажутся более рассеянными только потому, что они находятся вне фокальной плоскости изображения, но возбуждаются из-за толщины плоскости TFM-возбуждения, которая составляет около 15 мкм. На DEEP-TFM-изображении микросферы не в фокусе не видны. Таким образом, в дополнение к удалению артефактов рассеяния важно отметить, что DEEP-TFM повышает осевое разрешение по сравнению с TFM.

Далее, чтобы продемонстрировать изображение при 7 длинах рассеяния (аналогично TRAFIX), смесь микросфер размером 1 и 4 мкм была визуализирована через слой липидного раствора высокой концентрации (0,51%); микросферы не в фокусе, показанные на рисунке 3B1, снова исчезли на рисунке 3B2 благодаря повышенному осевому разрешению в DEEP-TFM. Очевидно, что для прочных образцов, таких как микросферы, в DEEP-TFM не был достигнут предел глубины даже при 7 длинах рассеяния; однако для реконструкции потребовалось 128 образцов и 2 длины рассеяния по сравнению с 256 образцами и 7 длинами рассеяния. Таким образом, скорость получения DEEP-TFM-изображений снизится, как и предполагалось при моделировании.

Тем не менее, даже при 7 длинах рассеяния для изображения 128 × 128 (px2), показанного на рисунке 3B2, DEEP в 64 раза быстрее, чем однопиксельная визуализация, такая как TRAFIX, при тех же условиях. Согласно результатам, некоторая пространственная информация доступна даже при больших длинах рассеяния (например, при 7 длинах рассеяния).

Рисунок 3. Результаты DEEP-TFM-визуализации флуоресцентных микросфер и ткани ex vivo. (A1) Изображение двухфотонной микроскопии с широкополосной временной фокусировкой (TFM) смеси микросфер размером 4 и 10 мкм, полученное через рассеивающую среду с 2 длинами рассеяния. (A2) DEEP-TFM-изображение поля обзора на рисунке A1, восстановленное после 128 измерений (Nt = 128). (B1 и B2) Соответственно TFM- и DEEP-TFM-изображения (Nt = 256) смеси микросфер размером 1 и 4 мкм, полученные через рассеивающую среду с 7 длинами рассеяния. (C1 и C2) Соответственно TFM- и DEEP-TFM-изображения (Nt = 128) образца почки мыши. Синим, зеленым и красным каналами обозначены соответственно ядро, конъюгированный агглютинин зародыша пшеницы Alexa Fluor 488 и F-актин. (D1 и D2) Соответственно TFM- и DEEP-TFM-изображения (Nt = 128) образца мышечной ткани мыши в плоскости изображения глубиной 190 мкм. Синим и красным каналами обозначены соответственно ядро (окрашенное Hoechst 33342) и F-актин (окрашенный Alexa Fluor 568 Phalloidin). (E) Репрезентативное изображение F-актина (красный канал) того же образца на рисунках D в плоскости изображения глубиной 170 мкм для сравнения TFM и DEEP-TFM-изображения (Nt = 128). Шкалы на рисунках (A)-(C) и (D) и (E) — 30 и 20 мкм соответственно

Экспериментальная демонстрация на биологических образцах ex vivo

Затем был визуализирован гистологический срез почки мыши ex vivo толщиной 16 мкм через 1,7 мм рассеивающего липидного раствора 0,15%, что соответствует 2 длинам рассеяния (рисунки 3С1 и 3С2). На рисунке 3C2 изображено немедленные улучшения контрастности изображения и соотношения сигнал/шум, достигнутые с помощью DEEP-TFM. Было также получено изображение среза мышечной ткани ex vivo толщиной 200 мкм с окрашенными ядрами (синий цвет, Hoechst 33342) и F-актина (красный цвет, Alexa Fluor 568 Phalloidin).

Поле обзора составляло почти 150 мкм × 150 мкм с разрешением 256 × 256 пикселей. Все реконструкции DEEP-TFM-изображений были выполнены после Nt = 128 измерений. Репрезентативные изображения для сравнения TFM и DEEP-TFM в плоскости глубиной 190 мкм показаны на рисунке 3D1 и 3D2. На рисунке 3E показано прямое сравнение TFM и DEEP-TFM в плоскости глубиной 170 мкм на одном и том же изображении F-актина. Видно, что в глубокой TFM-визуализации теряется значительное количество высокочастотных данных, при этом почти не видны детали с высоким разрешением. В то же время с помощью DEEP-TFM реконструируется большинство мелких деталей.

Экспериментальная демонстрация сосудистой сети мозга мыши in vivo

Использование вычислительных подходов для удаления артефактов рассеяния можно успешно применять к фиксированным образцам тканей, но не в сложных экспериментах in vivo. Поскольку вычислительные подходы разрабатываются для экспериментов по визуализации мозга с целью увеличения глубины, скорости и разрешения изображений, крайне важно оценить их эффективность для визуализации образцов биологического происхождения in vivo в медицине. В качестве первой демонстрации такого рода была проведена DEEP-TFM-визуализация сосудистой системы мозга мыши in vivo. Кровеносные сосуды мыши были помечены красителем родамин + декстран (70 килодальтон; D1841, Thermo Fisher Scientific).

Во время эксперимента поверхность мозга была визуализирована в качестве первой плоскости с прозрачными кровеносными сосудами, в то время как животное постепенно приближали к мишени с помощью механической ступени микроскопа для увеличения; затем с помощью моторизованного привода были получены изображения мозга на различных глубинах. Результаты, соответствующие глубине изображения 0 мкм (0 длин рассеяния, т.е. на поверхности), 100 мкм (от 2 до 2,4 длин рассеяния), 200 мкм (от 4 до 4,8 длин рассеяния) и 300 мкм (от 6 до 7 длин рассеяния) показаны на рисунках 4A, 4В, 4С и 4D, соответственно. Ранее учеными сообщалось, что длина рассеяния ткани мозга при длине волны излучения 630 нм составляет 42 мкм.

Однако следует сделать предположение о том, что длина рассеяния составляет от 42 до 50 мкм. В первой колонке представлено TFM-изображение, которое уже было размытым и зашумленным на поверхности из-за многократного рассеяния флуоресценции, излучаемой в прямом направлении и захваченной камерой. На 300 мкм структура кровеносного сосуда была почти подавлена рассеянным фоном фотонов, теряя почти все высокочастотные данные. Во второй и третьей колонках продемонстрированы реконструированные DEEP-TFM-изображения без предварительной и с предварительной регуляризацией разреженности вейвлет-преобразований.

В то время как реконструкция без регулировки на поверхности удовлетворительна, шум на заднем плане быстро возрастает по мере того, как глубина увеличивается до 300 мкм. Благодаря регуляризации разреженности можно визуализировать структуры с высокими разрешением и соотношением сигнал/шум. Несмотря на наличие помех, способность к реконструкции без предварительной регуляризации демонстрирует потенциал DEEP по сравнению с другими видами однопиксельной визуализации. При аналогичных условиях в однопиксельной визуализации требуется полагаться на датчик сжатия для восстановления во всех случаях, включая поверхность, описанную в данном исследовании.

Рисунок 4. Результаты DEEP-TFM-визуализации сосудистой сети мозга мыши in vivo. (A1) Изображение после двухфотонной микроскопии с широкополосной временной фокусировкой (TFM) кортикальной сосудистой сети в мозге мыши на поверхности. (A2) DEEP-TFM-изображение поля обзора на рисунке A1, восстановленное без использования регуляризации разреженности вейвлет-преобразований. (A3) DEEP-TFM-изображение поля обзора на рисунке A1, восстановленное с помощью регуляризации разреженности вейвлет-преобразований. (B1-B3) TFM-изображение и DEEP-TFM-реконструкция кортикальной сосудистой сети на 100 мкм ниже поверхности. (B2) — без регуляризации, (B3) — с регуляризацией. (C1-C3) TFM-изображение и DEEP-TFM-реконструкция кортикальной сосудистой сети в мозге мыши на 200 мкм ниже поверхности. (C2) — без регуляризации, (C3) — с регуляризацией. (D1-D3) TFM-изображение и DEEP-TFM-реконструкция кортикальной сосудистой сети в мозге мыши на 300 мкм ниже поверхности. (D2) — без регуляризации, (D3) — с регуляризацией. Все изображения были восстановлены по 256 шаблонам. Шкала — 20 мкм

Обсуждение

Был разработан новый подход к широкополосной многофотонной микроскопии, позволяющий проводить быструю и глубокую визуализацию образца биологического происхождения. Как смоделированные (рисунок 1), так и экспериментальные (рисунки 3 и 4) результаты демонстрируют потенциал DEEP-TFM для визуализации тканей биологического происхождения и мозга мыши in vivo. DEEP-TFM может разрешать детали изображения глубоких тканей биологического происхождения с качеством, аналогичным PSMPM, при высоком разрешении. Латеральное разрешение в DEEP-TFM определяется максимальным разрешением проецируемых шаблонов и, следовательно, соответствует PSMPM.

Результаты на рисунках 3A1 и 3A2 также свидетельствуют об улучшении осевого разрешения по сравнению с TFM. Результаты, описанные в данной статье, согласуются с исследованиями других ученых, в которых анализировалось шаблонное возбуждение для улучшения осевого разрешения TFM. Однако тщательное теоретическое обоснование этого эффекта еще предстоит разработать, и в будущем оно будет представлять собой важное исследование. Кроме того, во время исследования, описанного в данной статье, было доказано, что DEEP-TFM может увеличить глубину изображения в рассеивающих средах по меньшей мере до 7 длин рассеяния, используя информацию о шаблоне. Насколько известно, DEEP-TFM в настоящее время является единственным вычислительным методом широкополосной многофотонной визуализации с независимой от поля обзора частотой кадров.

Гипотетически, поля обзора миллиметрового размера с ограниченным дифракционным разрешением могут быть достигнуты без ущерба для скорости. Кроме того, DEEP-TFM уникальным образом обеспечивает гибкость скорости получения изображений, зависящую от глубины: неглубокая визуализация выполняется практически за один кадр, в то время как скорость получения изображений может быть настроена для каждой глубины в зависимости от величины рассеяния фотонов излучения. Таким образом, гипотетически, увеличение скорости более чем на три порядка по сравнению с PSMPM может быть достигнуто для объема 256 × 256 × 156 пикселей при одинаковом времени сбора данных за одно измерение (рисунок 1).

DEEP-TFM также удовлетворяет всем требованиям современной теории измерения сжатия. При подходящем предварительной регуляризации изображения может быть достигнуто дополнительное увеличение скорости в 10 раз. Более того, можно также обучить предварительную регуляризацию, индивидуальную для каждого образца, с помощью подходов к обучению, которые превзошли бы стандартную неиндивидуальную предварительную регуляризацию, например, регуляризацию разреженности вейвлет-преобразований.

Несмотря на то, что в ходе исследования, описанного в данной статье, были достигнуты достаточно высокие результаты работы с DEEP-TFM, практическое применение TFM для визуализации в области медицины все еще имеет ряд ограничений. В статье продемонстрирована визуализация с использованием 7 длин рассеяния в образцах ex vivo, в то время как в мозге мыши были продемонстрированы только 6-7 длин рассеяния. Проблема заключается в том, что максимальная мощность лазера, которую можно использовать при анализе мозга мыши, намного ниже (~ 100 МВт) из-за повреждения сосудов, вероятно, вызванного поглощением гемоглобина.

Это ограничение может быть преодолено путем переключения мощности возбуждения на более длинную длину волны, например, 1040 нм, на которой использовалось возбуждение мощностью до 1 Вт. Тем не менее, очевидно, что основным ограничением этого подхода является необходимость увеличения мощности для дальнейшего расширения поля обзора и повышения скорости получения изображения. Предстоящая работа по оптимизации этого класса подходов должна включать тепловое моделирование для определения максимально применимой мощности в зависимости от длины волны лазера, частоты повторения лазера, поля обзора изображения и поглощения образца.

Более того, можно также уменьшить предел тепловой мощности путем сокращения длительности лазерного импульса с 120 до 10-20 фс, поскольку эффективность возбуждения повышается линейно и квадратично для двух- и трехфотонной микроскопии соответственно. В конечном итоге, используемые в данном исследовании шаблоны имели коэффициент заполнения 50%; можно также исследовать шаблоны с более низкими коэффициентами заполнения, чтобы уменьшить общую мощность на образце при сохранении той же мощности на ограниченное дифракцией пятно.

Помимо фундаментальных ограничений, обусловленных фотофизикой повреждения образца, усовершенствование прибора и алгоритма также может значительно повысить производительность DEEP-TFM. Во-первых, текущая скорость реализации ограничена частотой кадров используемой EMCCD-камеры. DEEP-TFM и другие подобные подходы, такие как TRAFIX, требуют объединения информации из десятков или сотен изображений.

Следовательно, важным фактором, который может быстро ухудшить соотношение сигнал/шум итогового изображения, является шум считывания камеры. По этой причине была выбрана EMCCD-камера с низким уровнем шума при считывании, но ее частота кадров ~ 50-100 Гц ограничивает скорость получения итогового изображения. Это ограничение может быть преодолено за счет использования либо усиленных быстродействующих комплементарных металлоксидных полупроводниковых камер, либо матриц лавинных фотодиодов, которые в последнее время получили значительное распространение. Во-вторых, поскольку скорость DEEP-TFM не зависит от поля обзора, она линейно масштабируется вместе с полем обзора.

В данном исследовании было использовано поле обзора ~ 150 мкм × 150 мкм, но коммерческие высококачественные объективы с большой числовой апертурой имеют поле обзора почти 1000 мкм × 1000 мкм, в то время как кастомизированные объективы обладают миллиметровым масштабом. В-третьих, как и в случае с TRAFIX, одним из основных факторов, ограничивающих максимальную глубину изображения, является сохранение структуры освещения при увеличении глубины. Высокоточные шаблоны, вероятно, могут быть сформированы при однородном рассеянии за пределами 1-2 мм на основе трехфотонного возбуждения.

В исследованиях других ученых, однако, доказано, что шаблоны способны проникать в ткани биологического происхождения только на глубину в несколько сотен микрон при временной фокусировке. Основная проблема заключается в том, что шаблоны искажены из-за аберрации, возникающей в результате постоянной неоднородности образцов в образцах биологического происхождения. Искаженные шаблоны приводят к появлению артефактов на восстановленных изображениях. В будущем аберрации образцов на разных глубинах могут быть сведены к минимуму путем внедрения различных схем компенсации адаптивной оптики. В-четвертых, как упоминалось ранее, многие аспекты алгоритма могут быть оптимизированы.

В ходе исследования было продемонстрировано, что алгоритм предварительной регуляризации разреженности вейвлет-преобразований может значительно повысить результаты восстановления. Оптимальный алгоритм регуляризации, однако, вероятно, будет зависеть от типа образцов. Более современный подход заключается в использовании глубокой сверточной нейронной сети (dCNN), обученной на определенном классе образцов; этот подход позволит обучить оптимальный алгоритм восстановления изображений упомянутого класса образцов. В качестве альтернативы, можно было бы обучить алгоритм глубокой генеративной предварительной регуляризацией для какого-либо из классов образцов, чтобы заменить стандартную предварительную регуляризацию в текущем алгоритме оптимизации. Как предполагается, эти алгоритмы расширят диапазон глубины для количества шаблонов, описанных в данной статье, и повысят скорость получения изображений за счет возможности восстановления с меньшим количеством шаблонов.

Можно также отметить, что шаблон возбуждения (случайный, Адамара и т.д.) и его рабочий цикл также могут быть оптимизированы для того или иного класса образцов. Используя инструменты глубокого обучения, можно смоделировать проблему прямого изображения с использованием шаблонов в качестве обучаемых параметров. Затем эта модель может быть каскадирована с помощью dCNN-восстановителя для сквозной оптимизации. Такой подход позволит одновременно обучать оптимальные шаблоны, а также оптимальный алгоритм реконструкции для того или иного класса образцов. Тем не менее, несмотря на то, что многие аспекты DEEP-TFM могут быть дополнительно оптимизированы, данный подход позволяет получать изображения с большим полем обзора в 80 раз быстрее, чем TRAFIX (скорость рассчитана с использованием 256 шаблонов при времени экспозиции 50 мс на 1 кадр).

Таким образом, в статье представлен подход DEEP-TFM, новая вычислительная широкополосная технология для многофотонной микроскопии глубоких тканей. Согласно результатам, DEEP-TFM может разрешать детали изображения с качеством, аналогичным качеству точечной сканирующей двухфотонной микроскопии, но в широком поле обзора. Время получения изображений не зависит от поля обзора. Предполагается, что с помощью оптимизированных инструментов и алгоритмов DEEP-TFM может ускорить объемную многофотонную визуализацию на несколько порядков.

Материалы и методы

Двухфотонный широкополосный микроскоп с временной фокусировкой с шаблонным возбуждением

На рисунке 2А показана схема микроскопа с временной фокусировкой, который обеспечивает произвольное шаблонное возбуждение. Сначала сверхбыстрый импульсный лазерный луч [центральная длина волны 800 нм, длительность импульса 120 фс, частота повторения 10 кГц, диаметр луча ~ 8 мм (1/e2)] от регенеративного усилителя (Legend Elite, Coherent) был увеличен до ~32 мм и направлен на цифровое микрозеркальное устройство (DLP LightCrafter 9000 EVM, Texas Instruments).

Цифровое микрозеркальное устройство использовалось одновременно в качестве дифракционного элемента и генератора шаблонов. Луч дифрагировал от цифрового микрозеркального устройства с эффективным периодом ~190 линий/мм при угле падения 26,4°. Произвольные шаблоны были загружены в цифровое микрозеркальное устройство с помощью управляющей программы (DLP LCR 9000 GUI), предоставляемой Texas Instruments. За цифровым микрозеркальным устройством следует система линз на расстоянии 4f друг от друга, состоящая из двух плосковыпуклых линз (L1; f = 250 мм; LA1461, Thorlabs и L2; f = 125 мм; AC254-125-B-ML, Thorlabs), которые служили для проецирования и увеличения изображения цифрового микрозеркального устройства.

Затем изображения, сформированные L1 и L2, передавались на образец S через другую трубчатую линзу (L3; f = 300 мм; AC508-300-B-ML, Thorlabs) и линзу объектива (погружение в воду 20×/1,0, Zeiss). Системное увеличение составляет около 73х в зависимости от фокусных расстояний трубчатых линз и эффективного фокусного расстояния линзы объектива. Геометрическая дисперсия системы гарантировала достаточную ширину импульса, чтобы свести к минимуму многофотонное возбуждение за пределами плоскости образца. Положение объектива контролировалось с помощью пьезопозиционера объектива (MIPOS-500, Piezosystem Jena).

Флуоресценцию образца S, сгенерированную двухфотонным возбуждением, собирали с помощью той же линзы объектива с геометрией обнаружения типа epi и отражали дихроичным фильтром в виде дихроичного зеркала (Di03-R635-t3, Semrock) на камеру. Затем сигналы флуоресценции отображались другой трубчатой линзой L4 (f = 200 мм; PAC064, Newport) на камеру EMCCD (iXon+, Andor). Другая камера EMCCD (HNü 512, Nuvu Cameras) использовалась для визуализации мозга мыши in vivo. Для обнаружения цвета многоцветного объекта использовались три комбинации наборов фильтров: синий канал с центральной длиной волны 460 нм (Semrock FF01-460/60-25 и Chroma E530SP-SPC), зеленый канал с центральной длиной волны 535 нм (Chroma et535/70 M и Chroma ET680SP-2P8) и красный канал с центральной длиной волны 605 нм (Chroma ET605/70 M и Chroma E700SP-2P).

Пара ахроматических дублетных линз (1:2, MAP1050100-A, Thorlabs) использовалась для увеличения размера изображения на камере, а для генерации шаблона использовались пиксели цифрового микрозеркального устройства размером 1024 × 1024. Для изображений с большим размером пикселя (1600 × 1600) использовалась пара ахроматических двойных линз 1:1 (MAP107575-A, Thorlabs), чтобы изображение соответствовало размеру детектора. Данные с камеры передавались с помощью управляющей программы Andor Solis, предоставленной Andor, управляющей программы NuPixel, предоставленной Nuvu, либо управляющего программного обеспечения, имплементированного с помощью LabVIEW 2015 (National Instruments).

Подготовка калибровочных и рассеивающих образцов

Тонкий слой квантовых точек использовался для калибровки шаблонов для зеленого (535 нм) и красного каналов (605 нм). Тонкий флуоресцентный слой зеленых квантовых точек (QD Vision), диспергированный в гексане (10 мкл), наносили на покровное стекло (толщина 170 мкм) и давали высохнуть. Покровное стекло было прикреплено к предметному стеклу и запечатано прозрачным лаком для ногтей. Тонкий слой раствора 4,6-диамидино-2-фенилиндола использовали для калибровки шаблонов для синего канала (460 нм). Насыщенный раствор 4,6-диамидино-2-фенилиндола в смеси деионизированной воды и диметилсульфоксида в соотношении 1:1 помещали в прокладку с отверстиями (толщиной 120 мкм, герметичные прокладки для визуализации, Grace Bio-Labs) на предметное стекло, а поверх прокладки помещали покровное стекло. Покровное стекло было запечатано прозрачным лаком для ногтей.

Для демонстрации подхода использовали смесь желто-зеленых флуоресцентных микросфер размером 4 и 10 мкм (микросферы сульфата Флуосферы, 4,0 мкм; и микросферы полистирола Флуосферы, 10 мкм; Thermo Fisher Scientific). Смесь желто-зеленых флуоресцентных микросфер размером 4 мкм и 10 мкм опускали в теплый раствор агарозного геля 1% и тщательно перемешивали. Затем 25 мкл смеси капали в прокладку с предварительно проделанными отверстиями (толщиной 120 мкм) на предметном стекле, а поверх прокладки помещали покровное стекло. Покровное стекло было запечатано прозрачным лаком для ногтей. Предметное стекло оставляли остывать перед началом эксперимента для затвердевания.

Приготовление образцов тканей мыши

Был использован подготовленный срез разрезанной почки мыши (F24630, Invitrogen), чтобы продемонстрировать эффективность TF с шаблонным возбуждением. Предметное стекло содержит криостатный срез почки мыши толщиной 16 мкм, окрашенный агглютинином зародышей пшеницы Alexa Fluor 488, фаллоидином Alexa Fluor 568 и 4,6-диамидино-2-фенилиндолом. Деионизированная вода использовалась в качестве иммерсионной среды для случая без рассеяния, а раствор липидов 0,15% использовался в качестве иммерсионной среды для имитации среды рассеяния, поскольку толщина среза почки мыши составляет всего 16 мкм.

Протокол на использование животных в лабораторных исследованиях и процедура маркировки для визуализации мышечной ткани мыши ex vivo

Процедура использования животных в лабораторных исследованиях (транскардиальная перфузия) была одобрена Комитетом Массачусетского технологического института по лечению и использованию животных для экспериментов и соответствует руководящим принципам Национальных институтов здравоохранения (США) по лечению и использованию позвоночных животных в лабораторных исследованиях.

Мышей подвергали глубокой анестезии раствором авертина 1,25% (350 мг/кг внутрибрюшинно) и транскардиально перфузировали физиологическим раствором с фосфатным буфером, содержащим 4% параформальдегида. После перфузии мышцу бедра иссекали и фиксировали в параформальдегиде 4% на ночь. Мышечную ткань подвергали криозащите в сахарозе 30% в течение 48 часов, помещали в состав с оптимальной температурой резки (Tissue-Tek), замораживали при -20°C и делали срезы толщиной 200 мкм на криостате. Замороженные срезы погружали в фосфатный буфер для окрашивания. Растворы Alexa Fluor 568 Phalloidin (Invitrogen, A12380) и Hoechst 33342 (Invitrogen, H21492) готовили следующим образом: все содержимое флакона Alexa Fluor 568 Phalloidin 300-ед растворяли в метаноле (1,5 мл) для получения 40-кратного исходного раствора, который разбавляли в пропорции 1:40 в фосфатном буфере для окрашивания. Исходный раствор Hoechst готовили путем растворения Hoechst в воде в концентрации 10 мг/мл. Исходный раствор Hoechst разводили в пропорции 1:2000 в фосфатном буфере до конечной концентрации 5 мкг/мл для окрашивания.

Мышечные срезы пропитывали раствором 1% Triton X-100 в фосфатном буфере в течение 20 мин при комнатной температуре при легком встряхивании. Затем срезы инкубировали в рабочем растворе красителей (растворенных в фосфатном буфере, как описано выше) в течение 20 мин при комнатной температуре при легком встряхивании. Избыток красителя удаляли путем трехкратной промывки срезов в фосфатном буфере (по 6 минут на промывку при легком встряхивании при комнатной температуре). Затем срезы монтировали на предметные стекла, используя Fluoromount-G или Vectashield в качестве монтажного материала. Срезы были закрыты, и те, что содержали Vectashield в качестве монтажной среды, были запечатаны по краям покровного стекла прозрачным лаком для ногтей. Предметным стеклам давали высохнуть не менее чем за 48 часов до получения изображения.

Хирургическая процедура и подготовка к визуализации сосудистой сети мыши in vivo

Эксперименты проводились в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом Массачусетского технологического института по лечению и использованию животных для экспериментов, и соответствовали руководящим принципам Национальных институтов здоровья (США). Все данные в исследовании были собраны у взрослых (возрастом >8 недель) мышей обоих полов. Мыши были дикими и приобретены в лаборатории Джексона (США) (#000664).

Мышей первоначально анестезировали изофлураном в кислороде 4% и поддерживали на изофлуране 1,5-2% в течение всей операции. Бупренорфин (1 мг/кг, подкожно) и/или мелоксикам (1 мг/кг, подкожно) вводили перед операцией каждые 24 часа в течение 3 дней для уменьшения воспаления. Для защиты глаз животного во время операции использовалась офтальмологическая мазь. Температуру тела поддерживали на уровне 37,5°C с помощью грелки. Скальп, покрывающий дорсальную часть черепа, был продезинфицирован и удален. Надкостницу удалили скальпелем и произвели трепанацию черепа (5 мм) над первичной зрительной корой (V1, на 4,2 мм к задней части, на 3,0 мм латеральнее брегмы) либо в левом, либо в правом полушарии, оставив твердую мозговую оболочку неповрежденной. Для визуализации кальция круглое покровное стекло (3 мм; Warner Instruments) было имплантировано поверх краниотомии в виде черепного окна и запечатано стоматологическим акрилом (C& B-Metabond, Parkell), смешанным с черными чернилами для уменьшения светопропускания.

Приготовленная пластина из нержавеющей стали (eMachineShop.com) была прикреплена к черепу с помощью стоматологического акрила. Эксперименты проводили по меньшей мере через 5 дней после имплантации пластины, чтобы дать животным возможность восстановиться. Для маркировки кровеносных сосудов флуоресцентным красителем на ретроорбитальную область наносили краситель родамин + декстран (70 килодальтон; D1841, Thermo Fisher Scientific), смешанный с физиологическим раствором в концентрации 5% (в/в), объемом 100 мкл. Во время ретроорбитальной инъекции животное анестезировали раствором изофлурана в кислороде 2%. Во время многофотонной визуализации животное анестезировали смесью кетамин + ксилазин объемом 0,1 мл, и эту смесь применяли по мере необходимости после проверки рефлексов. Сеансы визуализации длились максимум 2 часа.

Составление и проекция шаблона

Случайное или рандомизированное блочное изображение по шаблону Адамара было сгенерировано с помощью MATLAB. Чтобы получить рандомизированные блочные шаблоны Адамара, сначала была создана матрица Адамара размером Nt × Nt (здесь Nt — количество шаблонов). Затем каждая строка матрицы использовалась для создания повторяющегося блока. Чтобы сгенерировать полный шаблон, блоки были объединены в мозаику, чтобы максимально увеличить расстояние между повторяющимися пикселями по шаблону временных рядов.

Затем полученные полные шаблоны были умножены на ту же самую абсолютно случайную маску (из +1s и −1s), чтобы получить рандомизированный набор изображений по шаблону Адамара. В экспериментах с микросферами и почкой мыши для возбуждения использовались шаблоны размером 1024 × 1024 пикселей, увеличенные в 8 раз. Эта комбинация определяет единичный блок размером 8 × 8 пикселей в цифровом микрозеркальном устройстве, что соответствует 60,8 мкм для длины одной стороны. Соответствующий размер единичного блока в плоскости образца составляет 0,83 мкм, что близко к эффективному пределу дифракции системы [λ/(2NA²)].

Общее количество шаблонов для каждого сеанса визуализации составило 256 для полного базового набора. Для визуализации мышц мыши были использованы шаблоны 1600 × 1600 пикселей в цифровом микрозеркальном устройстве для увеличения поля обзора системы с помощью модификации увеличительной линзы перед камерой EMCCD. Время экспозиции камеры регулировалось в диапазоне от 100 до 500 мс на образец в зависимости от интенсивности сигнала образца. Коэффициент усиления камеры с вторично-электронным умножителем также был установлен на уровне от 3 до 100 в зависимости от интенсивности сигнала образца.

Компания INSCIENCE помогает своим заказчикам решать любые вопросы и потребности
по поставке оборудования на территории РФ