В данной работе представлен метод структурированной рамановской микроскопии (structured illumination Raman microscopy (SIRM)), разработанный для преодоления ключевых ограничений традиционной рамановской спектроскопии — низкого пространственного разрешения и медленной скорости сканирования. Метод основан на комбинации широкопольной рамановской детекции с принципами структурированной освещённости (structured illumination method (SIM)).
Метод широкопольной рамановской детекции применяется для получения рамановского изображения с большой площади. Техника основана на применении специализированных полосных фильтров и камер и других методов сбора данных включающих оптоволокно и спектрометр. Преимущества широкоугольной рамановской спектроскопии уже было раскрыто для множества применений в том числе для характеризации углеродных материалов и биологических образцов. В изучении графена метод применялся для различения однослойного и многослойных областей, позволяет достичь высокого и быстрого контраста в трех измерениях. Разрешение данного метода ограничено дифракцией примерно половиной длины волны.
Для улучшения разрешения в работе был использован метод структурированного освещения. Этот метод основан на освещении образца лазерным пучком модулированным в виде в виде муаровского паттерна. Таким образом, разрешение системы может быть улучшено в два раза для линейных методов и даже более для нелинейных методов.
Данный метод может использоваться только совместно с пространственным модулятором на жидких кристаллах (liquid spatial light modulator (SLM)) в связке с рамановской спектроскопией с улучшенной поверхностью (surface-enhanced Raman scattering (SERS)).
Экспериментальная установка и используемое оборудование
Схематичное изображение структурированного освещения в рамановской микроскопии. (a) Оптическая система экспериментальной установки: SF (spatial filter) – пространственный фильтр, PL (polarizer) – поляризатор, HP (half-wave plate) – полуволновая пластинка, OBJ (objective) – объектив, DM (dichroic mirror) – дихроичное зеркало, LPF (long-pass filter) – фильтр коротких длин волн, TLF/TSF (tunable long/short-pass filters) – перестраиваемые фильтры, FM (filter module) – модуль фильтров, TL (tube lens) – тубусная линза. (b) Многоступенчатый фазовый сдвиг с использованием кодированного DMD-паттерна. (c) Зависимость угла поляризации от дифракционных порядков ±1 решётки в плоскости пространственного фильтра. Белые стрелки указывают направление поляризации, зелёные точки обозначают ±1 дифракционные порядки. (d) Калибровка спектрального разрешения фильтрующего модуля. Слева: изменение пропускания при различных полосах пропускания фильтра. Справа: измеренное пропускание при сканировании центральной длины волны в диапазоне 1050–2950 см⁻¹ с шагом 50 см⁻¹.
Схематичное изображение экспериментальной установки показано на рисунке. В качестве источника лазерного излучения применялся Laser QUANTUM, Torus на 532 нм, совмещенный с расширителем пучка (Thorlabs, BE02-05-A). Для генерации структурированного света использовалось цифровое микрозеркальное устройство (DMD, Texas Instruments, DLP LightCrafter6500 EVM) с регулируемыми углами и фазами. Решетка генерировала три порядка дифракции, 0, +1 и -1, в плоскости Фурье ахроматической линзы (L1, Thorlabs, AC254-200-A). В фокусе линзы L1 устанавливался специальный пространственный фильтр (spatial filter (SF)), настроенный таким образом, чтобы блокировать нулевой порядок и рассеянный свет, создаваемый DMD. Таким образом, только ±1 порядоки разрешены для прохождения через пространственный фильтр.
Для получения рамановского изображения, свет фокусировался системой линз 4-f (L2, L3, Thorlabs, AC254-200-A) в задней фокальной плоскости объектива (Olympus, IX-73), создавая на образце интерференционную картину в режиме полного внутреннего отражения (total internal reflection fluorescence (TIRF)). Между линзами L2 и L3 устанавливались поляризатор (PL, Thorlabs, LPVISC100-MP2) и полуволновая пластинка (HP, Thorlabs, AHWP10M-600), с помощью которых регулировалась поляризация для получения высокой контрастности рисунка в плоскости образца.
Детекция рамановского сигнала осуществлялась через тот же объектив с последующим подавлением отраженного лазерного излучения и рассеяния Релея при помощи дихроичного зеркала (Semrock FF538-FDi01-25×36) и пары фильтров коротких длин волн (Semrock BLP01-532R-25). Ключевым элементом спектральной селекции стал перестраиваемый фильтр-модуль (Semrock TLP01-628/TSP01-628), установленный в моторизованном ротаторе (Thorlabs, KPRM1E) перед тубусной линзой (TL, Thorlabs, TTL180-A) и обеспечивающий выделение целевых рамановских полос с полушириной 50 см⁻¹ (FWHM) и пропусканием >75%.
Регистрация изображений выполнялась гиперспектральной камерой Hamamatsu ORCA-Flash 4.0, а для получения рамановских спектров применялся перестраиваемый спектрометр Ocean Insight QE65pro.
Исследуемые образцы и широкополосные рамановские изображения
Процедура сверхразрешающей реконструкции требовала записи минимум 9 исходных изображений (3 ориентации полос × 3 фазы). Ключом к успешной реконструкции являются алгоритмы поиска параметров схемы освещения, таких как пространственная частота, фазовый сдвиг и глубина модуляции. Были введены различные алгоритмы для оценки параметров и правильной демодуляции компонентов с целью повышения эффективности реконструкции. Для подавления влияния шума во время реконструкции, применялись алгоритмы деконволюции Винера и Ричарда-Люси.
Это позволяло извлекать высокочастотную информацию образца, смещённую в низкочастотную область, и достигать пространственного разрешения 80 нм, что вдвое лучше дифракционного предела. Экспериментальная проверка метода включала три этапа:
- Калибровку разрешения на наностержнях Au-Ag (50×100 нм) с поверхностно-усиленным Рамановским рассеянием от молекул 4-MBA;
- Визуализацию однослойных углеродных нанотрубок (single-walled carbon nanotubes (SWCNTs)) по G-полосе (~1590 см⁻¹), где удалось разрешить перекрывающиеся нанотрубки и нанокольца;
- Мультиспектральную съёмку дефектного графена по D-полосе (1335–1385 см⁻¹, дефекты) и G-полосе (1565–1615 см⁻¹, кристаллическая фаза), выявившую распределение дефектов в субдифракционном масштабе.
Визуализация фрагментов однослойного графена. (a) Широкопольное рамановское изображение. (b) Реконструированное изображение SIRM. (c, d) Локальные увеличенные изображения белой квадратной области, обозначенной на (a) и (b). (e) Профили интенсивности фрагментов графена, обозначенных пунктирными линиями на (c) и (d).
Преимущества SIRM подтверждены высокой скоростью съёмки: изображение области 32×32 мкм с разрешением 1024×1024 пикселей получалось за 9 секунд при мощности лазера 32 мВт. Установка продемонстрировала потенциал для оперативного in situ анализа углеродных материалов, включая контроль дефектов в графене и мониторинг процессов роста нанотрубок, что открывает перспективы её применения в промышленной диагностике и материаловедении.
Выводы
Подводя итог, можно сказать, что метод SIRM повышает пространственное разрешение рамановской визуализации примерно до половины дифракционного предела при использовании метода структурированного освещения. SIRM демонстрирует преимущества в пространственном разрешении и пропускной способности системы по сравнению с традиционным методом. Этот высокопроизводительный метод широкопольной рамановской визуализации открывает большие возможности для мониторинга динамических процессов, таких как рост CVD-материалов и доставка лекарственных препаратов в биологических образцах.
На основе публикации: https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsphotonics.1c00392
Компания INSCIENCE помогает своим заказчикам решать любые вопросы и потребности по продукции ©Semrock , ©Thorlabs на территории РФ.