В биомедицинских исследованиях существует фундаментальная проблема визуализации: необходимость получения четких изображений клеток и тканей на большой глубине. Прямая визуализация видимым светом хоть и обеспечивает высокое разрешение, но быстро теряет качество из-за рассеяния в биологических тканях, что ограничивает глубину проникновения. Используя ближний инфракрасный свет можно получить изображение на большей глубине, но сама картинка выходит размытой. Таким образом, появилась потребность в методе, который сочетает в себе высокое разрешение и большую глубину проникновения.
Поглощение и рассеяние света в биологических тканях: УФ-излучение полностью поглощается, видимый свет рассеивается, а ближний инфракрасный диапазон обеспечивает глубокую визуализацию с минимальными потерями. (Источник https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X20300582 )
Ап-конверсионные наночастицы как решение
Использование наночастиц с ап-конверсией (UCNPs), которые при возбуждении одним лазером (975 нм) могут излучать свет на двух длинах волн 455 нм (видимый свет) и 800 нм (ближний инфракрасный) решает проблему получения четких изображених клеток и тканей. Это позволяет создать систему, где один канал используется для коррекции искажений, а другой — для получения высококачественного изображения.
Upconversion nanoparticles (UCNPs) — это нанокристаллы, легированные ионами редкоземельных элементов (например, Yb³⁺ и Tm³⁺). Их ключевое свойство — ап-конверсия: процесс, при котором поглощение нескольких фотонов низкой энергии (например, из ближнего инфракрасного диапазона) приводит к испусканию одного фотона более высокой энергии (в видимом диапазоне).
Существует специальный вид этих наночастиц, который может излучать сразу на двух длинах волн:
800 нм: Легко возбуждается, дает сильный сигнал, хорошо проникающий через ткань.
455 нм: Возбуждается только в очень маленьком объеме в фокусе лазерного излучения, что обеспечивает высокое пространственное разрешение и контраст, но его сложнее зарегистрировать на глубине из-за рассеяния.
а) Энергетическая схема ап-конверсии в UCNPs, легированных Yb³⁺/Tm³⁺. б) При возбуждении на 975 нм реализуется двойная эмиссия: пик при 455 нм (высокое пространственное разрешение) и пик при 800 нм (глубокое проникновение в ткань). (Источник: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.5c01030?goto=supporting-info )
Такое сочетание свойств делает UCNPs удобными для разработки новых оптических систем. На их основе был предложен метод HDU-AO (Homologous Dual-emission Adaptive Optics), где два канала излучения выполняют разные функции: инфракрасный используется для коррекции искажений, а видимый — для получения четких изображений.
Метод HDU-AO: принцип работы и экспериментальные результаты
Принцип работы HDU-AO следующий: наночастицы, легированные ионами Tm³⁺ и Yb³⁺, возбуждаются непрерывным лазером с длиной волны 975 нм и одновременно излучают в двух диапазонах — 455 нм (видимый свет) и 800 нм (ближний ИК). Благодаря этому можно разделить задачи: ИК-сигнал служит для измерения и компенсации аберраций, а видимый сигнал используется для построения финального изображения с высоким разрешением.
Схема работы метода HDU-AO: наночастицы UCNPs излучают на двух длинах волн (800 нм и 455 нм) при возбуждении лазером 975 нм. Инфракрасный канал (800 нм) используется для измерения и коррекции аберраций с помощью датчика Шака–Гартмана и адаптивной оптики, а видимый канал (455 нм) — для получения изображения с высоким разрешением. (Источник: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.5c01030?goto=supporting-info )
Процесс начинается с возбуждения наночастиц UCNPs в биологическом образце лазером 975 нм. Инфракрасное излучение (800 нм), менее подверженное рассеянию в тканях, используется как калибровочный сигнал. Его волновой фронт анализируется датчиком Шака-Гартмана: массив микролинз фокусирует свет на ПЗС-матрицу, а смещение фокальных пятен позволяет построить карту аберраций. На основе этих данных адаптивный оптический элемент (деформируемое зеркало или пространственный модулятор света) компенсирует искажения.
Схема датчика Шака-Гартмана: массив микролинз формирует изображение на фотоприемнике, который фиксирует смещения при искаженном волновом фронте (Источник: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Shack_Hartmann_Wavefront_Sensor.png )
После коррекции волнового фронта система переходит к регистрации сигнала видимой эмиссии на 455 нм. Так как аберрации были устранены с помощью глубоко проникающего ближнего инфракрасного канала, фокус для коротковолнового излучения также восстанавливается. Сигнал видимого диапазона регистрируется детектором, например, фотоэлектронным умножителем, что позволяет получить финальное изображение с высоким разрешением.
Экспериментальные результаты подтверждают эффективность предложенного метода. В ходе модельных испытаний с образцами из полимера PDMS, в которые были внесены контролируемые аберрации, система HDU-AO продемонстрировала способность точно измерять и компенсировать указанные искажения. При исследовании среза мозга мыши толщиной 500 мкм было установлено, что в отсутствие коррекции наблюдался размытый сигнал с низким отношением сигнал/шум. После применения адаптивной оптики было достигнуто высокое разрешение изображения, а отношение сигнал/шум увеличилось в 5 раз.
Метод обладает существенными практическими преимуществами: технологической доступностью, безопасностью и адаптивностью. Применение непрерывного лазера вместо сложных фемтосекундных установок не только снижает стоимость экспериментальной конфигурации, но и минимизирует фотоповреждение и фотодеградацию биологических образцов. Гибкая настройка состава и легирования UCNPs обеспечивает подбор рабочих длин волн для различных экспериментальных условий, позволяя балансировать между глубиной сканирования и разрешением. Данный подход представляет собой изящное инженерное решение, использующее два свойства наночастиц для одновременного решения задач зондирования среды и визуализации.
Демонстрация эффективности HDU-AO при визуализации наночастиц через срез мозга мыши толщиной 500 мкм. До коррекции адаптивной оптикой сигнал размыт и с низким контрастом; после коррекции восстанавливается четкость и повышается отношение сигнал/шум. (Источник: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.5c01030?goto=supporting-info )
Шаг к новой эпохе биомедицинской микроскопии
В итоге, метод HDU-AO эффективно объединяет адаптивную оптику и нанофотонику, позволяя использовать ближний инфракрасный канал для измерения и коррекции аберраций, а видимый канал — для получения изображения с дифракционным разрешением на большой глубине в рассеивающих средах, используя при этом простую лазерную систему. Это открывает новые возможности для долговременного и детального наблюдения за биологическими структурами в глубоких тканях с минимальным фотоповреждением.
Для реализации методов HDU-AO ключевую роль играют современные технологии адаптивной оптики и высокочувствительных детекторов. Компания JCOPTIX предлагает высокоскоростные цифровые микрозеркальные устройства (SLM Ultra-High-Speed Digital Micromirror Devices), которые идеально подходят для формирования волнового фронта и компенсации аберраций в реальном времени. Для регистрации слабых сигналов видимого диапазона и анализа волнового фронта используются высокочувствительные фотоэлектронные умножители и датчики Шака-Гартмана, которые предлагает Thorlabs.
Компания INSCIENCE занимается поставкой комплексных решений в области биомедицинской микроскопии и адаптивной оптики. Ознакомиться с полным каталогом оборудования и подобрать компоненты под свои задачи можно на сайте INSCIENCE.