Спиральный фазовый контраст в микроскопии

Введение

Для повышения контраста наблюдаемых амплитудных и фазовых объектов в оптической микроскопии применяются такие методы, как темнопольная и фазово-контрастная микроскопия. Эти методы основаны на фильтрации информации об изображения в его Фурье-плоскости с применением спиральных фазовых пластин.

Метод основан на голографической фильтрации изображения объекта в Фурье-плоскости с использованием спиральной фазовой пластины (также называемым вихревым фазовым или спиральным фазовым фильтром) в виде внеосевой голограммы. Фильтрация с помощью вихревого фазового элемента приводит к сильному изотропному усилению краевого контраста как амплитудной, так и фазовой составляющей. Разрешение изображения увеличивается на порядки, что позволяет, в частности, оценить толщину объекта в нанометровом масштабе.

Свойства спирально-фазового фильтра в плоскости Фурье

В недавних исследованиях функция спиральной фильтрации предлагалась в качестве двумерного обобщения одномерного преобразования Гильберта. Показано, что такой вид фазового сдвига в Фурье-пространстве соответствует свертке амплитуды изображения с функцией ядра r^-2 exp(iϕ) в реальном пространстве. Очевидно, свертка с такой функцией ядра заменяет каждую точку изображения в точечно-симметричной среде или однородной области нулем. Зависимость функции ядра от угловой координаты ϕ показывает, что любой вклад в интеграл свертки от одной точки изображения уравновешивается отрицательным вкладом центрально-симметричной противоположной точки. Те же рассуждения предполагают, что свертка дает максимумы интенсивности на амплитудных или фазовых краях изображения. Из-за сферической симметрии ядра метод является изотропным. После фильтрации распределение интенсивности становится пропорциональным градиенту интенсивности исходного изображения, общая интенсивность изображения сохраняется. Теория предполагает, что таким образом удастся обнаружить скачки фазы или фронтов на порядки меньшие, чем обнаруживаемые с помощью метода фазового контраста.

Рисунок 1. Моделирование сдвига фазы в методе фазового контраста и в методе спирального фазового контраста. На рисунке А показан результат фазового контрастирования изображения с шагом фазы 0,25% от длины волны. Контрастность изображения составляет 6%. Аналогичное моделирование выполнено в методе спиральной фазовой визуализации, контраст изображения составляет 100%. На графике справа показан результирующий контраст изображения, полученного методом микроскопии фазового контраста (осциллирующий) и методом спирального фазового контраста (равный 1 в любой точке).

В моделировании шага фазы методом фазового контраста маска фильтра состоит из массива «единиц», причем только один измененный пиксель в центре маски состоит из мнимой единицы «i», соответствующей относительному сдвигу фазы π/2 между центром и другими частями фильтра. Модель спирального фазового фильтра строится на комплексной фазовой функции exp(iϕ), где центральный пиксель (r =0) установлен в 0. Расчет контраста полученного изображения в зависимости от высоты фазового шага показан на графике (рис. 1). Оказалось, что контраст во втором случае всегда равен единице, т. е. фоновый шум полностью подавляется. В первом случае (метод фазового контраста) контрастность изображения неоднородная: увеличивается пропорционально росту фазового сдвига и достигает полной модуляции при фазовом сдвиге π/2, а затем уменьшается до нуля при сдвиге фазы на π - так как в этом случае нулевой элемент ряда Фурье обращается в нуль.

Экспериментальная установка

Схема экспериментальной установки показана на рис. 2. В предметной плоскости инвертирующего микроскопа (Zeiss Axiovert 125) размещен прозрачный образец, который освещается одномодовым лазерным диодом с длиной волны 780 нм. На рисунке показано распространение лазерного излучения. Проходящий свет собирается объективом микроскопа (увеличение 10 или 20 крат). За объективом расположена пара оборачивающих линз. Задняя фокальная плоскость сопряжена с плоскостью изображения, то есть содержит преобразование Фурье, содержащее информацию об амплитуде изображения. Пространственный модулятор света Holoeye 3000 имеет разрешение 1920 x 1200 пикселей, отображает отражающую фазовую голограмму, служащую для фильтрации сигнала. Пространственный модулятор управляется с компьютера.

Рисунок 2. Схема экспериментальной установки. Фильтрация изображения проводилась с использованием голографических решеток А-D

Падающая световая волна дифрагирует на фазовой голографической решетке, отображаемой на пространственном модуляторе. Фазовая решетка обладает абсолютной дифракционной эффективностью приблизительно 35%. Нежелательные порядки дифракции блокируются (не указанных на рисунке). Визуализация предмета выполняется с помощью третьего объектива, расположенного симметрично (на фокусном расстоянии) между пространственным модулятором и ПЗС-чипом.

На рис. 3 слева показано яркое изображение буквы внутри образца (размер 250 мкм), которое было записано с использованием голографической отражающей решетки на пространственном модуляторе.

На изображении ниже показана улучшенная версия буквы с краевым контрастом, полученная путем переключения дисплея пространственного модулятора на изображение спиральной фазовой голограммы. Численное сравнение интегральных интенсивностей двух изображений показывает, что они равны, хотя и перераспределены. Для сравнения записано изображение темного образца при переключении дисплея пространственного модулятора на отражающую решетку с небольшой непрозрачной сферой в центре, что привело к подавлению света, рассеянного от центра голограммы. Результат напоминает изображение, полученное методом спиральной фазовой фильтрации на рис.3, однако яркость и контрастность сильно уменьшаются. Это результат отбрасывания нулевой составляющей ряда Фурье, несущей в себе большую часть общей интенсивности света.

Рисунок 3. Слева направо: яркое, контрастное и темное изображение поглощающего образца (размер общей площади изображения 400 х 300 мкм). Все три снимка были сделаны при одинаковом освещении и настройках камеры

Основное преимущество спиральной фазовой фильтрации становится очевидным при визуализации объектов с небольшими сдвигами фазы. Пример показан на рис. 4. В верхнем ряду расположены два изображения одного и того же участка фазового объекта - царапины в стеклянном покровном стекле, покрытом водой.

Рисунок 4. Усиление контраста при визуализации фазовых объектов. Яркие изображения (A, C) и изображения, полученные методом спиральной фазовой фильтрации (B, D) одних и тех же выборочных областей фазового объекта

По сравнению с осевыми спиральными фазовыми элементами (такими как спиральная волновая пластина или дифракционная оптика на оси) внеосевой голографический метод имеет преимущество в том, что все части дифрагированной волны от изображения автоматически приобретают желаемый фазовый сдвиг. Ограничения свойств пространственного модулятора, такие как электронный шум, нежелательное дополнительное вращение поляризации или нелинейные свойства влияют только на дифракционную эффективность, но не на чистоту фильтрации в первом порядке дифракции.

На разрешение изображения влияет разрешающая способность пространственного модулятора. В качестве эмпирической оценки соотношения берется количество фактически освещенных пикселей матрицы пространственного модулятора: оно должно превышать количество оптически разрешимых пикселей наблюдаемого объекта в микроскопе.

Заключение

Сравнение метода спирального фазового контраста с методом темнопольной микроскопии и методом фазового контраста обнаружило значительное усиление краевого контраста. Это обусловлено перераспределением интенсивности в выходном изображении, которое, благодаря пространственному модулятору с высоким разрешением, становится пропорциональным градиенту интенсивности, сохраняя при этом общую интенсивность изображения. Метод спирального фазового контраста позволяет визуализировать фазовые скачки, которые составляют порядка 1% длины волны.

© Holoeye

Компания INSCIENCE помогает своим заказчикам решать любые вопросы и потребности по продукции Holoeye на территории РФ