Методы и средства люминесцентной микроскопии

Введение

В настоящее время люминесцентная микроскопия является мощным аналитическим инструментом прикладной биофотоники. К наиболее продвинутым методам люминесцентной визуализации можно отнести конфокальную флуоресцентную и мультифотонную микроскопию. В этой статье речь пойдет о достоинствах и недостатках таких систем при исследовании клеточных структур и тканей различного генезиса, а также о ключевых производителях оборудования данной направленности. Особое внимание будет уделено возможности расширения функционала систем флуоресцентной визуализации за счет использования методов и средств измерения времени жизни люминесценции с помощью коррелированного во времени подсчета фотонов (TCSPC FLIM).

Содержание

В конфокальной флуоресцентной микроскопии основным элементом оптического тракта является пространственный фильтр, представляющий собой точечную диафрагму, отсеивающую внефокусное излучение. Название метод получил благодаря свойству регистрировать флуоресцентный свет, который испускается объектом, исключительно из области вблизи фокальной плоскости. Флуоресценция специального красителя, введенного в образец, возбуждается непрерывным или импульсным лазерным источником с предельной средней мощностью порядка нескольких десятков милливатт (уровень флуоресценции линейно зависит от мощности возбуждающего излучения). Группа интерференционных фильтров подавляет линию возбуждения и пропускает в канал фоторегистрации лишь неупруго рассеянную - флуоресцентную компоненту излучения.

Конфокальная микроскопия

Регистрация изображения осуществляется поточечным сканированием области интереса, в том числе и по вертикальной оси, что позволяет проводить объемную реконструкцию рельефа исследуемого образца. Математические методы обработки (в частности, деконволюция) получаемого массива данных значительно повышают пространственное разрешение таких систем. Конфокальная микроскопия предъявляет требования к качеству лазерного пучка по метрике M², ограничивая качество уровнем 1,2 и менее. Пространственный фильтр вносит весомые потери по интенсивности регистрируемого флуоресцентного излучения, что заставляет повышать время экспозиции и использовать фотоприемники повышенной чувствительности (ФЭУ или лавинные фотодиоды). Высокий уровень средней мощности возбуждающего излучения значительно увеличивает тепловую нагрузку на образец и приводит к фотообесцвечиванию – уменьшению уровня флуоресценции за счет деградации люминофора при длительном воздействии возбуждающего излучения высокой интенсивности, что заметно ограничивает использование данного метода микроскопии. 

Рисунок 1 – Типовая схема конфокального микроскопа

К числу основных производителей конфокальных микроскопов можно отнести такие компании как Zeiss (Германия), Nikon (Япония), Olympus (Япония), Leica (Германия), BestScope (Китай). Так, например, конфокальная система ZEISS LSM 900 - Airyscan 2 установлена в научно-технологическом центре биомедицинской фотоники Орловского университета, где с её помощью проводится изучение молекулярных процессов в клетках, клеточных культурах, тканях головного мозга. 

Рисунок 2 – Использование конфокального микроскопа в научно-технологическом центре биомедицинской фотоники Орловского университета

Мультифотонная микроскопия

Альтернативой флуоресцентной конфокальной микроскопии по уровню разрешающей способности выступает мультифотонная, в частности двухфотонная, микроскопия. В этом случае используется явление двухфотонного поглощения с рождением высокоэнергетического фотона. Фактически речь идет о регистрации нелинейного отклика среды. Вероятность такого события крайне мала и зависит от квадрата интенсивности возбуждающего излучения. В отличие от флуоресцентной визуализации, в мультифотонной микроскопии источником возбуждения служит длинноволновый источник лазерного излучения, а люминесценция происходит в коротковолновой видимой области спектра. Таким образом, вероятность возникновения и влияния паразитной аутофлуорисценции исследуемого образца сведена к минимуму. 

Рисунок 3 – Отличие флуоресцентной и мультифотонной эмиссии

Ввиду использования длинноволнового излучения накачки, увеличивается степень проникновения излучения в биологические ткани и жидкости, благодаря чему качество объемного сканирования исследуемых образцов по сравнения с конфокальной флуоресцентной микроскопией заметно улучшается. Однако мультифотонная микроскопия предъявляет высочайшие требования к лазерному источнику возбуждения, его энергия должна быть сконцентрирована не только в минимальной пространственной области, но и в минимально возможной временной области. В мультифотонные системы устанавливаются фемтосекундные источники длительностью импульса менее 100-150 фс. Фемтосекундные лазеры обеспечивают необходимую импульсную мощность, но при этом сохраняют низкую среднюю мощность, что снижает тепловую нагрузку на исследуемый образец и не допускает фотообесцвечивания. Качество пучка по метрике M² также требуется предельно высоким, менее 1,1-1,15.

Рисунок 4 – Типовая схема мультифотонного микроскопа с FLIM интеграцией

Среди основных производителей мультифотонных систем можно отметить такие компании, как Zeiss (Германия), Nikon (Япония), Olympus (Япония), Bruker (США), Thorlabs (США). Так, например, мультифотонный микроскоп Bergamo II от компании Thorlabs установлен в инжиниринговом центре микротехнологии и диагностики университета ЛЭТИ (Санкт-Петербург).

Рисунок 5 – Мультифотонная визуализация тканей лёгкого лабораторной мыши

FLIM микроскопия

К числу методов исследования динамических процессов в клеточных структурах можно отнести методики определения времени жизни люминесценции, в частности, корреляционный способ подсчета неупруго рассеянных фотонов с использованием техники синхронизации однофотонных счетчиков с импульсом возбуждения - TCSPC FLIM. Подобное оборудование легко интегрируется в базовые системы конфокальной флуоресцентной и мультифотонной микроскопии, однако предъявляет существенные требования к источникам возбуждения люминесценции и фотодетекторам. В частности, необходимы лазерные источники коротких, либо ультракоротких импульсов, детекторы одиночных фотонов и системы их синхронизации. Лидером в производстве таких аппаратных средств является компания Becker & Hickl (Германия). Эта фирма предлагает готовые решения для конфокальной и мультифотонной микроскопии (DCS-120 Confocal FLIM System и DCS-120 MP Multiphoton FLIM System), оборудование для интеграции в базовые микроскопы (в частности, систему SPC-150), а также специализированное программное обеспечение SPCImage и другое. При этом фотодетекторы могут быть использованы как от Becker & Hickl, так и от сторонних производителей, к примеру, Hamamatsu (Япония).

Заключение

Средства и методы конфокальной и мультифотонной микроскопии позоляют значительно повысить разрешающую способность систем флуоресцентной визуализации и обеспечить пространственное разрешение вплоть до нескольких сотен нанометров (субволновая разрешающая способность), а дополнительная интеграция программно-аппаратных средств отслеживания времени жизни флуоресценции расширяет возможности по изучению динамики химико-биологических процессов в тканях, клеточных структурах и других исследуемых образцах.

Ознакомиться с каталогом решений Becker & Hickl можно здесь.

Компания INSCIENCE занимается поставкой решений в области конфокальной, мультифотонной, а также FLIM микроскопии.