Проблематика
Флуоресцентные изображения живых объектов могут быть искажены из-за их движения. Автофлуоресцентные изображения обычно характеризуются низкой интенсивностью, что затрудняет точное определение времени жизни флуоресценции. Увеличение времени накопления нежелательно из-за движения живого объекта, а увеличение мощности возбуждающего излучения может повредить объект.
Автофлуоресцентные изображения ноги водяной блохи записаны с помощью TCSPC FLIM с конфокальной системой Becker & Hickl DCS-120 при длине волны возбуждения 470 нм. Формат изображения 256 х 256 пикселей, 256 временных каналов. Изображения записывались одиночными кадрами по 0,5 секунд. Зарегистрированных 3 – 30 фотонов на пиксель недостаточно для адекватного измерения времени жизни, даже при биннинге 5 x 5 пикселей.
Рисунок 1 – Изображения водяной блохи, записанные с длительностью кадра 0,5 с. Изображения созданы с помощью программного обеспечения SPCImage NG. Среднее (взвешенное по амплитуде) время жизни, биннинг 5 x 5 пикселей
Решение: временная мозаика FLIM
Предлагаемый метод временной мозаики заключается в записи изображений временных рядов. Пример записи временной мозаики FLIM ноги водяной блохи показан на рисунке 2.
Рисунок 2 – Временная мозаика FLIM на примере водяной блохи. 64 изображения, каждое изображение записано в одном кадре длительностью 0.5 секунд. Изображения 256 x 256 пикселей, 256 временных каналов
Обработка данных путем сегментации векторного изображения
Отдельные изображения мозаики не отличаются от изображений, представленных на рисунке 1. Однако в отличие от обычного временного ряда, мозаика FLIM представляет собой не последовательность отдельных наборов данных FLIM, а распределение отдельных фотонов. Поэтому его можно загрузить в программное обеспечение для анализа данных SPCImage как отдельное изображение и проанализировать (рисунок 3), а затем рассчитать общий векторный график мозаики.
Векторная диаграмма (рисунок 4) показывает пиксели изображения (в данном случае мозаики) на амплитудно-фазовой диаграмме (фазорная модель). Положение на этой диаграмме зависит от временной формы данных затухания, а не от положения на изображении. Таким образом, кластер пикселей, выбранный на векторной диаграмме (эллипс на рисунке 4), содержит пиксели с одинаковыми сигнатурами затухания независимо от их положения на изображении и движения отдельных элементов.
Выборка, сделанная на рисунке 4, выделяет оранжевые пиксели на изображении FLIM. Можно провести обратную аннотацию выбранных пикселей (рисунок 5). Комбинация данных затухания выбранных пикселей в одной кривой затухания показана на рисунке 5, справа внизу. Эта кривая содержит более 500 миллионов фотонов, что обеспечивает высокую точность анализа.
Рисунок 3 – Данные временной мозаики FLIM, загруженные в SPCImage NG
Рисунок 4 – Временная мозаика FLIM, загруженная в SPCImage NG, с активированным векторным графиком
Рисунок 5 – Выбор оранжевых пикселей, обратная аннотация в мозаике и объединение в единую кривую затухания
Заключение
Точный анализ времени жизни флуоресценции движущегося объекта возможен путем записи временной мозаики отдельных кадров и выбора кластеров с заданной сигнатурой затухания на векторной диаграмме SPCImage NG. Пиксели в пределах выбранного кластера представляют части объекта независимо от расположения в отдельных элементах мозаики FLIM. Данные затухания этих пикселей суммируются. В результате получается одна кривая затухания с большим числом фотонов, что обеспечивает высокую точность анализа.
Ознакомиться с каталогом Becker & Hickl можно здесь.
Компания INSCIENCE занимается поставкой решений в области визуализации времени жизни флуоресценции.
Метод временной мозаики FLIM позволяет повысить точность визуализации времени жизни флуоресценции движущихся объектов. Метод основан на записи массива (мозаики) изображений, построении и анализе векторной диаграммы мозаики с помощью специального ПО Becker & Hickl.
С помощью системы Becker & Hickl DCS-120 MP со сверхбыстрыми детекторами для визуализации времени жизни флуоресценции исследуется флуоресценция спор различных видов грибов. Исследуются чрезвычайно быстрые компоненты с временем затухания 8 – 80 пс и амплитудами до 99,5% в функциях затухания.
В статье исследуется, как изменения параметров в методах обработки поверхности подложек приводят к изменениям в процессах адгезии, подчеркивая особенности взаимодействия между методами обработки серной кислотой и УФ-излучением, используя изображения, полученные с помощью интерферометры белого света.
В обзоре сравниваются модели наносекундных лазеров от уже зарекомендовавших себя производителей и их потенциальные аналоги: Ekspla, Litron, Quantel, Bright Solutions, Hubner photonics, CNI, Солар ЛС, Inngu laser, Grace laser, Beamtech.
В работе предлагается оптический детектор контуров, основанный на отражающей витой жидкокристаллической q-пластине. Устройство состоит из зеркала и жидкокристаллического слоя толщиной 1,46 мкм с углом скручивания 69,2°.
Задача создания микроструктур с большим соотношением глубины и ширины в кремниевых подложках актуальна для производства МЭМС. Технология лазерно-водоструйного скрайбирования продемонстрировала возможность создания глубоких канавок с низкой конусностью в кремнии.
г. Санкт-Петербург, улица Савушкина 83, корп. 3
