Прецизионная визуализация времени жизни флуоресценции движущегося объекта

Проблематика

Флуоресцентные изображения живых объектов могут быть искажены из-за их движения. Автофлуоресцентные изображения обычно характеризуются низкой интенсивностью, что затрудняет точное определение времени жизни флуоресценции. Увеличение времени накопления нежелательно из-за движения живого объекта, а увеличение мощности возбуждающего излучения может повредить объект.

Автофлуоресцентные изображения ноги водяной блохи записаны с помощью TCSPC FLIM с конфокальной системой Becker & Hickl DCS-120 при длине волны возбуждения 470 нм. Формат изображения 256 х 256 пикселей, 256 временных каналов. Изображения записывались одиночными кадрами по 0,5 секунд. Зарегистрированных 3 – 30 фотонов на пиксель недостаточно для адекватного измерения времени жизни, даже при биннинге 5 x 5 пикселей.

Рисунок 1 – Изображения водяной блохи, записанные с длительностью кадра 0,5 с. Изображения созданы с помощью программного обеспечения SPCImage NG. Среднее (взвешенное по амплитуде) время жизни, биннинг 5 x 5 пикселей

Решение: временная мозаика FLIM

Предлагаемый метод временной мозаики заключается в записи изображений временных рядов. Пример записи временной мозаики FLIM ноги водяной блохи показан на рисунке 2.

Рисунок 2 – Временная мозаика FLIM на примере водяной блохи. 64 изображения, каждое изображение записано в одном кадре длительностью 0.5 секунд. Изображения 256 x 256 пикселей, 256 временных каналов

Обработка данных путем сегментации векторного изображения

Отдельные изображения мозаики не отличаются от изображений, представленных на рисунке 1. Однако в отличие от обычного временного ряда, мозаика FLIM представляет собой не последовательность отдельных наборов данных FLIM, а распределение отдельных фотонов. Поэтому его можно загрузить в программное обеспечение для анализа данных SPCImage как отдельное изображение и проанализировать (рисунок 3), а затем рассчитать общий векторный график мозаики.

Векторная диаграмма (рисунок 4) показывает пиксели изображения (в данном случае мозаики) на амплитудно-фазовой диаграмме (фазорная модель). Положение на этой диаграмме зависит от временной формы данных затухания, а не от положения на изображении. Таким образом, кластер пикселей, выбранный на векторной диаграмме (эллипс на рисунке 4), содержит пиксели с одинаковыми сигнатурами затухания независимо от их положения на изображении и движения отдельных элементов. 

Выборка, сделанная на рисунке 4, выделяет оранжевые пиксели на изображении FLIM. Можно провести обратную аннотацию выбранных пикселей (рисунок 5). Комбинация данных затухания выбранных пикселей в одной кривой затухания показана на рисунке 5, справа внизу. Эта кривая содержит более 500 миллионов фотонов, что обеспечивает высокую точность анализа.

Рисунок 3 – Данные временной мозаики FLIM, загруженные в SPCImage NG

Рисунок 4 – Временная мозаика FLIM, загруженная в SPCImage NG, с активированным векторным графиком

Рисунок 5 – Выбор оранжевых пикселей, обратная аннотация в мозаике и объединение в единую кривую затухания

Заключение

Точный анализ времени жизни флуоресценции движущегося объекта возможен путем записи временной мозаики отдельных кадров и выбора кластеров с заданной сигнатурой затухания на векторной диаграмме SPCImage NG. Пиксели в пределах выбранного кластера представляют части объекта независимо от расположения в отдельных элементах мозаики FLIM. Данные затухания этих пикселей суммируются. В результате получается одна кривая затухания с большим числом фотонов, что обеспечивает высокую точность анализа.

Ознакомиться с каталогом Becker & Hickl можно здесь.

Компания INSCIENCE занимается поставкой решений в области визуализации времени жизни флуоресценции.