Выявление сверхбыстрых компонентов затухания по двухфотонной визуализации времени жизни флуоресценции спор грибов

Введение

Измерение времени жизни флуоресценции грибных спор – инструмент исследования механизма защиты грибных спор от УФ излучения. Известно, что время жизни флуоресценции спор грибов может составлять менее 100 пс. Типичные однофотонные конфокальные системы с возбуждением диодным лазером фиксируют время жизни, но не позволяют надежно разложить функции затухания на отдельные компоненты. Многофотонная система DCS-120 MP производства Becker & Hickl, используется для измерения времени жизни флуоресценции спор нескольких видов грибов и позволяет выделить сверхбыстрый компонент со временем жизни порядка 10 пс. Подобные значения не характерны ни для одного известного флуорофора, что предполагает наличие сложного механизма, обуславливающего эту особенность.

Эксперимент

Многофотонная система DCS-120 MP основана на быстром сканировании, двухфотонное возбуждение осуществляется фемтосекундным волоконным лазером (Toptica Femto Fibre Pro), а обнаружение – сверхбыстрыми гибридными детекторами (Becker&Hickl HPM-100-06). Данные регистрируются с помощью многомерной технологии счета одиночных фотонов с корреляцией по времени (модули Becker&Hickl SPC-150NX TCSPC FLIM). Отклик DCS-120 MP составляет ~18 пс, что в 5 раз быстрее, чем у аналогичной типичной системы на основе диодного лазера с гибридными детекторами GaAsP, и в 10 раз быстрее, чем для систем визуализации времени жизни флуоресценции с традиционными фотоэлектронными умножителями.

Фрагменты шляпок свежих грибов помещены на предметные стекла толщиной 180 мкм. Для визуализации времени жизни флуоресценции предметные стекла помещаются на подставку для образцов инвертированного микроскопа. Используется объектив с масляной иммерсией с числовой апертурой NA = 1,3 и 40-кратным увеличением. Испускаемые фотоны регистрируются многофотонной сканирующей FLIM системой DCS-120 MP компании Becker&Hickl. Фильтр коротких частот Chroma SP 700 используется для подавления рассеянного лазерного излучения, а фильтр длинных частот 400 нм – для подавления возможного СВЧ-излучения. В результате, спектральный диапазон измеряемой флуоресценции составляет ~ 400 – 650 нм.

Так как споры, особенно темных цветов, поглощают излучение на длине волны возбуждающего лазера и легко им разрушаются, установлен уровень мощности лазера не выше 1.5 – 2 МВт. Из-за низкой мощности лазера скорость обнаружения фотонов составляет не более 200 000 отсчетов в секунду для белых спор и не более 20 000 отсчетов в секунду для темных спор. В результате, время сбора данных составляет 1 – 10 мин. Такой продолжительный сбор данных возможен благодаря высокой стабильности синхронизации экспериментальной системы и скоростью подсчета фона детектором не более 60 отсчетов в секунду.

Результаты

По результатам построения кривых затухания, интегрированных по пикселям одной споры, и расчетам среднего времени жизни флуоресценции, обнаружены следующие интересные факты. Во-первых, происходит непрерывный переход от «нормальных» затуханий к затуханиям со сверхбыстрым компонентом. Во-вторых, время жизни быстрого компонента тем меньше, а амплитуда тем выше, чем темнее споры. Одновременно уменьшается интенсивность медленных компонентов.

Функции затухания, обнаруженные в ходе этих экспериментов, уникальны, так как не существует известного флуорофора, который имел бы время жизни флуоресценции в диапазоне от 10 до 20 пс.

Рисунок 1 – Споры со временем жизни t₁ быстрого компонента от 380 до 100 пс. Время жизни t₁ (от красного до синего = от 0 до 800 пс), распределение t₁ по пикселям, кривая затухания в выбранном месте и текстовое поле с описанием вида, цвета спор, t₁, амплитуды a₁ и коэффициента увеличения при регистрации. Размер поля составляет 500 мкм / зум 

Рисунок 2 – Споры со временем жизни t₁ быстрого компонента менее 100 пс. Время жизни t₁ (от красного до синего = от 0 до 100 пс), распределение t₁ по пикселям, кривая затухания в выбранном месте и текстовое поле с описанием вида, цвета спор, t₁, амплитуды a₁ и коэффициента увеличения при регистрации. Размер поля составляет 500 мкм / зум

Интерпретация результатов

Чтобы объяснить такое короткое время жизни флуоресценции, исследователи предлагают две модели:

• Можно предположить, что поглотитель, присутствующий в темных спорах, флуоресцирует, но сильно гасится каким-либо внутримолекулярным процессом дезактивации. Большая концентрация поглотителя обуславливает больший размер агрегированных частиц и более короткое время жизни. Однако эта модель не объясняет наблюдаемое снижение интенсивности медленных компонентов на несколько порядков даже при небольшой концентрации поглотителя.

• Альтернативной моделью является межмолекулярный перенос энергии: энергия передается от «нормальных» флуорофоров (доноров) к нефлуоресцентному поглотителю (акцептору). В результате подавляется «нормальная» флуоресценция и, соответственно, уменьшается время жизни и интенсивность флуоресценции. Время жизни оставшейся флуоресценции зависит от эффективности соединения. Доля невзаимодействующих молекул и, соответственно, доля «нормальной» флуоресценции зависит от концентрации поглотителя. Необъяснимыми особенностями являются чрезвычайно высокая скорость передачи энергии, необходимая для объяснения короткого времени жизни, и постепенное изменение времени затухания быстрого компонента с цветом спор. Возможно, коэффициенты поглотителей различных видов отличаются, или эффективность соединения повышается при высокой концентрации акцептора, или эффективность передачи энергии возрастает с увеличением числа агрегированных частиц.

Окончательно утвердить какую-либо модель может помочь спектральный анализ флуоресценции. Проблема заключается в отсутствии спектрального детектора для визуализации времени жизни флуоресценции, соответствующего временному разрешению гибридного детектора HPM-100-06. Решением проблемы могут выступить последовательные измерения с использованием узкополосных фильтров.

Ознакомиться с каталогом Becker & Hickl можно здесь.

Компания INSCIENCE занимается поставкой решений в области двухфотонной визуализации времени жизни флуоресценции.